1. Esialgne arusaam

Selles etapis peame mõistma mõningaid mõisteid ja terminoloogiat, et vältida vanemate inimeste ees vigu, näiteks:

K: Mis vahe on RT-PCR, qPCR, reaalajas PCR ja reaalajas RT-PCR vahel?

Vastus: RT-PCR on pöördtranskriptsiooni PCR(pöördtranskriptsiooni PCR, RT-PCR), mis on polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) laialdaselt kasutatav variant.RT-PCR-is transkribeeritakse RNA ahel komplementaarseks DNA-ks, mida seejärel kasutatakse matriitsina DNA amplifikatsioonil PCR abil.
Reaalajas PCR ja qPCR(Kvantitatiivne reaalajaline PCR) on sama asi, mõlemad on reaalajas kvantitatiivsed PCR, mis tähendab, et igal PCR-i tsüklil on reaalajas andmekirjed, nii et alustavate mallide arvu saab täpse analüüsiga reguleerida.

Kuigi nii reaalajas PCR (real-time fluorescent quantitative PCR) kui ka pöördtranskriptsiooni PCR (pöördtranskriptsiooni PCR) näivad olevat lühendatud kui RT-PCR, on rahvusvaheline konventsioon järgmine: RT-PCR viitab konkreetselt pöördtranskriptsioonile.PCR, reaalajas PCR on üldiselt lühendatud kui qPCR (kvantitatiivne reaalajas PCR).

Ja reaalajas RT-PCR (RT-qPCR), see on pöördtranskriptsiooni PCR koos fluorestsents-kvantitatiivse tehnoloogiaga: esmalt hankige RNA pöördtranskriptsioonist cDNA (RT) ja seejärel kasutage kvantitatiivseks analüüsiks (qPCR) reaalajas PCR-i.Enamik laboreid tegeleb RT-qPCR-ga, see tähendab RNA ekspressiooni allareguleerimise uurimisega, nii et qPCR, millest kõik laboris räägivad, viitab tegelikult RT-qPCR-ile, kuid ärge unustage, et kliinilistes rakendustes on endiselt palju DNA-teste.Kvantitatiivne analüüs, näiteks B-hepatiidi viiruse HBV tuvastamine.

Küsimus: Miks peaks pärast suure hulga fluorestseeruva kvantitatiivse PCR lugemist kontrollima amplifitseeritud fragmenti vahemikus 80–300 aluspaari?

Vastus: Iga geenijärjestuse pikkus on erinev, mõned on mitu kb, mõned on sadu aluspaari, kuid praimerite kavandamisel peame nõudma, et toote pikkus oleks 80-300 bp, liiga lühike või liiga pikk ei sobi fluorestseeruva kvantitatiivse PCR tuvastamiseks.Tootefragment on liiga lühike, et seda praimer-dimeerist eristada.Praimer-dimeeri pikkus on umbes 30-40bp ja raske on eristada, kas tegemist on praimer-dimeeriga või tootega, kui see on alla 80bp.Kui produkti fragment on liiga pikk, ületades 300 aluspaari, põhjustab see kergesti amplifikatsiooni madalat efektiivsust ega suuda geeni kogust tõhusalt tuvastada.

Näiteks kui loendate, kui palju inimesi on klassiruumis, peate ainult loendama, kui palju suud on.Sama kehtib ka siis, kui tuvastate geene, peate tuvastama ainult teatud geenijärjestuse, et esindada kogu järjestust.Kui tahad inimesi kokku lugeda, pead kokku lugema nii suud kui ninad, kõrvad ja prillid ning vigu on lihtne teha.

Laienduseks võib öelda, et bioloogilistes uuringutes on palju uurimisjuhtumeid ühest kohast teise, kuna mis tahes liigi geenijärjestus on väga pikk, on tarbetu ja võimatu mõõta kõiki fragmente, näiteks bakteriaalne 16S sekveneerimine, milleks on bakterite konservatiivse järjestuse läbiviimine Analüüsid, et järeldada teatud bakteripopulatsiooni arv.

K: Mis on qPCR praimeri disaini optimaalne pikkus?

Vastus: Üldiselt on praimeri pikkus umbes 20–24 bp, mis on parem.Loomulikult peame praimeri projekteerimisel tähelepanu pöörama krundi TM väärtusele, sest see on seotud optimaalse anniilimistemperatuuriga.Pärast paljusid katseid on tõestatud, et 60°C on parem TM väärtus.Kui lõõmutamistemperatuur on liiga madal, põhjustab see kergesti mittespetsiifilist võimendust.Kui lõõmutamistemperatuur on liiga kõrge, on võimenduse efektiivsus suhteliselt madal, võimenduskõvera haripunkt algab hiljem ja CT väärtus hilineb.

K: Mille poolest erineb värvimismeetod sondimeetodist?

Vastus: VärvimeetodMõned fluorestseeruvad värvained, nagu SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO jne, ei kiirga iseenesest valgust, vaid kiirgavad fluorestsentsi pärast kaheahelalise DNA väiksema soonega seondumist.Seetõttu ei suuda masin PCR-reaktsiooni alguses fluorestsentssignaali tuvastada.Kui reaktsioon jõuab anniilimise-pikenemise staadiumisse, kahekordne ahel avatakse ja DNA polümeraasi toimel sünteesitakse uus ahel ning fluorestseeruv molekul seondub dsDNA väikese soonega.PCR-i tsüklite arvu suurenedes kombineeritakse üha rohkem värvaineid kaheahelalise DNA-ga ja ka fluorestsentssignaal paraneb pidevalt.Värvimismeetodit kasutatakse peamiselt teadusuuringutes.
PS: Olge katse tegemisel ettevaatlik, värvaine peab olema kombineeritud inimese DNA-ga, olge ettevaatlik, et muuta see fluorestseeruvaks inimeseks.

Värvimismeetod (vasakul) Sondimeetod (paremal)
PS: Olge katse tegemisel ettevaatlik, värvaine peab olema kombineeritud inimese DNA-ga, olge ettevaatlik, et muuta see fluorestseeruvaks inimeseks.

SYBR Green Ⅰ seondub DNA väiksema soonega

Sondi meetodTaqmani sond on kõige sagedamini kasutatav hüdrolüüsisond.Sondi 5'-otsas on fluorestseeruv rühm, tavaliselt FAM, ja sond ise on sihtgeeniga komplementaarne järjestus.3'-otsas on fluorestseeruv summutusrühm.Vastavalt fluorestsentsresonantsenergia ülekande (Försteri resonantsenergia ülekanne, FRET) põhimõttele, kui reporterfluorestseeruv rühm (doonorfluorestsentsmolekul) ja kustutav fluorestseeruv rühm (aktseptorfluorestsentsmolekul) on ergastatud Kui spektrid kattuvad ja kaugus on doonori fluorestsentsmolekul või fluorestsentsmolekul väga lähedal (7-10 nm), siis ergastatakse. ule, samas kui autofluorestsents on nõrgenenud.Seetõttu ei kiirga reporterfluorestseeruv rühm PCR reaktsiooni alguses, kui sond on süsteemis vaba ja puutumatu, fluorestsentsi.Lõõmutamisel seostuvad praimer ja sond malliga.Pikendamise etapis sünteesib polümeraas pidevalt uusi ahelaid.DNA polümeraasil on 5′-3′ eksonukleaasi aktiivsus.Sondi jõudes hüdrolüüsib DNA polümeraas sondi matriitsist, eraldab reporterfluorestseeruva rühma kustutaja fluorestsentsrühmast ja vabastab fluorestsentssignaali.Kuna sondi ja malli vahel on üks-ühele seos, on sondimeetod testi täpsuse ja tundlikkuse poolest värvimeetodist parem.Sondimeetodit kasutatakse peamiselt diagnoosimisel.

K: Mis on absoluutne kvantifitseerimine?Mis on suhteline kvantifitseerimine?

Vastus: Absoluutne kvantifitseerimine viitab qPCR-iga testitava proovi esialgse koopiaarvu arvutamisele, näiteks kui palju HBV viiruseid on 1 ml veres.Suhtelise kvantifitseerimise teel saadud tulemus on sihtgeeni koguse muutus konkreetses proovis võrreldes teise võrdlusprooviga ning geeniekspressioon on üles- või allareguleeritud.

K: Kas RNA ekstraheerimise kogus, pöördtranskriptsiooni efektiivsus ja amplifikatsiooni efektiivsus mõjutavad katsetulemusi?
K: Kas proovide säilitamine, ekstraheerimisreaktiivid, pöördtranskriptsiooni reaktiivid ja valgust läbilaskvad tarbekaubad mõjutavad katsetulemusi?
K: Millise meetodiga saab katseandmeid parandada?

Nende probleemidega seoses kirjeldame neid üksikasjalikult allpool täpsemates ja täpsemates jaotistes.
2. Täiustatud teadmised

Seoses reaalajas fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-iga peame tunnistama reaalsust, et igal aastal avaldatakse tuhandeid teaduslikke uurimistöid, mille hulgas on fluorestsents-kvantitatiivne PCR-tehnoloogia.

Kui fluorestsents-kvantitatiivse PCR katse mõõtmiseks puudub ühtne standard, võivad tulemused olla väga erinevad.Sama liigi sama geeni ja sama töötlemismeetodi puhul on tuvastamistulemused samuti väga erinevad ja hilinenud tulijatel on raske samu tulemusi korrata.Sina Keegi ei tea, mis on õige ja mis vale.

Kas see tähendab, et fluorestsents-kvantitatiivne PCR on petutehnoloogia või ebausaldusväärne tehnoloogia?Ei, selle põhjuseks on asjaolu, et fluorestseeruv kvantitatiivne PCR on tundlikum ja täpsem ning veidi vale toiming annab täiesti vastupidised tulemused.Väike kaotus on tuhande miili kaugusel.Artikli autorit võivad arvustajad korduvalt piinata.Samas on ka ajakirja retsensente erinevate katsetulemuste hulgast raske valida.

Kokkuvõttes osutades konsensuse puudumisele reaalajas PCR-katsetes.Selleks hakkasid tööstuse vanemteadlased koostama standardeid,nõutakse, et kaastöötajad esitaksid artiklis mõned vajalikud katse- ja andmetöötlusandmed (sealhulgas vajalikud andmed), et nendele standarditele vastata .

Ülevaatajad saavad neid üksikasju lugedes hinnata katse kvaliteeti;tulevased lugejad saavad seda kasutada ka katse kordamiseks või katse täiustamiseks.Siis on sel viisil saadud katsetulemused inforohked, kvaliteetsed ja kasutatavad.

MIBBI (minimaalne teave bioloogiliste ja biomeditsiiniliste uuringute jaoks –http://www.mibbi.org) tekkis.MIBBI on projekt, mis pakub katsetele standardeid.See avaldatakse looduses.See projekt on suunatud erinevatele bioloogilistele katsetele, sealhulgas rakubioloogiale, Microarray-le, qPCR-ile, mida me praegu arutame jne, ning näeb käsikirjade esitamisel ette igat tüüpi katseid.Seda teavet tuleks alati esitada.

MIBBI projektis on kaks fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-iga seotud artiklit, nimelt:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – struktureeritud keel ja aruandlusjuhend reaalajas kvantitatiivsete PCR andmete jaoks;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimaalne teave reaalajas kvantitatiivseid PCR katseid käsitlevate artiklite avaldamiseks.
Esiteks räägime RDML-ist, terminoloogia spetsifikatsioonist.

Kui kõige jaoks pole standarddefinitsiooni, on arutelu jätkamine võimatu, mistõttu on terminite selgitamine eksamil nii oluline.
Fluorestsents-kvantitatiivses PCR-katses kasutatud terminoloogia sisaldab järgmist sisu.QIAGEN on teinud meie jaoks parima kokkuvõtte.Järgmised on kõik kuivadkaubad .

Amplifikatsioonikõver
Amplifikatsioonikõver viitab PCR protsessi käigus tehtud kõverale, kus tsükli number on abstsiss ja reaalajas fluorestsentsi intensiivsus reaktsiooni ajal on ordinaat.

Suurepärasel võimenduskõveral peaksid olema järgmised omadused: baasjoon on tasane või veidi langenud ja ilmset tõusutrendi pole;kõvera käänupunkt on selge ja eksponentsiaalse faasi kalle on võrdeline võimenduse efektiivsusega.Mida suurem on kalle, seda suurem on võimenduse efektiivsus;üldine võimenduskõver Paralleelsus on hea, mis näitab, et iga toru võimendusefektiivsus on sarnane;madala kontsentratsiooniga proovide võimenduskõvera eksponentsiaalne faas on ilmne.

Algtase (alustase)
Lähteväärtus on varajase tsükli müratase, mõõdetakse tavaliselt 3. ja 15. tsükli vahel, kuna amplifikatsiooniproduktist põhjustatud fluorestsentsi väärtuse suurenemist ei ole sel perioodil võimalik tuvastada.Algtaseme arvutamiseks kasutatavate tsüklite arv võib varieeruda ja seda võib olla vaja vähendada, kui kasutatakse suuri matriitsi koguseid või kui sihtgeeni ekspressioonitase on kõrge.

Lähtejoone määramiseks on vaja vaadata lineaarsuse võimenduskõvera fluorestsentsi andmeid.Baasjoon on seatud nii, et amplifikatsioonikõvera kasv algab tsükli numbriga, mis on suurem kui baasjoone tsükli tippnumber.Algtasemed tuleb määrata iga sihtjärjestuse jaoks eraldi.Varajastes tsüklites tuvastatud keskmised fluorestsentsi väärtused tuleb lahutada amplifitseeritud produktide fluorestsentsi väärtustest.Erinevate reaalajas töötava PCR-tarkvara uusimad versioonid võimaldavad üksikute proovide algseadistuste automaatset optimeerimist.

PCR amplifikatsioonireaktsiooni esimeste tsüklite jooksul ei muutu fluorestsentssignaal palju.Sirgele lähenemist nimetatakse baasjooneks, kuid kui vaatame tähelepanelikult paari esimest tsüklit, näeme, et baasjoone sees toimub see, mis alloleval pildil toimub.

Taust Taust viitab
reaktsiooni mittespetsiifiline fluorestsentsi väärtus.Näiteks: ebaefektiivne fluorestsentsi kustutamine;või suur hulk kaheahelalisi DNA malle tänu SYBR Greeni kasutamisele.Signaali taustkomponendid eemaldatakse matemaatiliselt Real-Time PCR tarkvara algoritmi abil.

Reporteri signaal
Reportersignaal viitab fluorestsentssignaalile, mis on genereeritud SYBR Greeni või fluorestseeruvalt märgistatud järjestusspetsiifiliste sondide poolt reaalajas PCR-i käigus.

Normaliseeritud reporteri signaal (RN)
RN viitab reportervärvi fluorestsentsi intensiivsusele jagatuna passiivse etalonvärvi fluorestsentsi intensiivsusega, mõõdetuna igas tsüklis.

Passiivne võrdlusvärv
Mõnes reaalajas PCR-isfluorestsentsvärvi ROX kasutatakse sisemise võrdlusalusena fluorestsentssignaali normaliseerimiseks.See korrigeerib ebatäpsest pipeteerimisest, süvendi asukohast ja fluorestsentsi kõikumisest tingitud erinevusi süvendite kaupa.

Fluorestsentsi lävi (lävi)
reguleeriti üle taustväärtuse ja oluliselt alla amplifikatsioonikõvera platoo väärtuse.See peab asuma amplifikatsioonikõvera lineaarses piirkonnas, esindades PCR tuvastamise log-lineaarset vahemikku.Log-amplifikatsioonikõvera vaates tuleks seada läved, et PCR-i logaritmiline lineaarne faas oleks hõlpsasti tuvastatav.Kui reaalajas PCR-is on mitu sihtgeeni, tuleb iga sihtmärgi jaoks määrata lävi.Üldiselt kasutatakse fluorestsentsi taustsignaalina PCR-reaktsiooni esimese 15 tsükli fluorestsentssignaali ja fluorestsentsi lävi on 10-kordne PCR esimese 3–15 tsükli fluorestsentssignaali standardhälve ja fluorestsentsi lävi määratakse PCR-i eksponentsiaalses amplifikatsioonifaasis.Üldiselt on igal instrumendil enne kasutamist määratud fluorestsentsi lävi.

Tsükli lävi (CT) või piiriületuspunkt (CP)
Tsükkel, mille jooksul amplifikatsioonikõver ületab läve (st punkt, kus fluorestsentsi tuvastamine suureneb oluliselt).CT võib olla murdosa ja lähtemalli kogust saab arvutada.CT väärtus tähistab tsüklite arvu, mida kogetakse, kui fluorestseeruv signaal igas PCR-reaktsioonituubis saavutab seatud läve.Iga malli CT väärtuse ja malli algse koopianumbri logaritmi vahel on lineaarne seos.mida suurem on algkoopia number, seda väiksem on CT väärtus ja vastupidi.Standardkõvera saab koostada, kasutades teadaoleva esialgse koopianumbriga standardit, kus abstsisstell tähistab CT väärtust ja ordinaat tähistab esialgse koopianumbri logaritmi.Seega, seni, kuni saadakse tundmatu proovi CT väärtus, saab proovi esialgse koopiaarvu arvutada standardkõveralt.

ΔCT väärtus
ΔCT väärtus kirjeldabsihtgeeni ja vastava endogeense võrdlusgeeni CT väärtuse erinevus, nagu majapidamisgeen, ja seda kasutatakse kasutatava malli koguse normaliseerimiseks:
⇒ΔCT = CT (sihtgeen) – CT (endogeenne võrdlusgeen)

ΔΔCT väärtus
ΔΔCT väärtus kirjeldab erinevust huvipakkuva proovi (nt stimuleeritud rakud) keskmise ΔΔCT väärtuse ja võrdlusproovi (nt stimuleerimata rakud) keskmise ΔΔCT väärtuse vahel.Võrdlusproovi nimetatakse ka kalibreerimisprooviks ja kõik teised proovid normaliseeritakse suhtelise kvantifitseerimise jaoks sellele:
⇒ΔΔCT = keskmine ΔCT (huvitav proov) – keskmine ΔCT (võrdlusproov)

Endogeensed võrdlusgeenid (endogeensed võrdlusgeenid)
Endogeensete võrdlusgeenide, näiteks majapidamisgeenide (majapidamisgeenide) ekspressioonitasemed ei erine proovide vahel.Võrdlusgeeni CT väärtuste võrdlemine sihtgeeniga võimaldab sihtgeeni ekspressioonitaseme normaliseerida sisend-RNA või cDNA kogusega (vt ülaltoodud jaotist ΔCT väärtuste kohta).

Sisemised võrdlusgeenid sobivadvõimalik RNA lagunemine või ensüümi inhibiitorite esinemine RNA proovides, samuti RNA sisalduse variatsioonid, pöördtranskriptsiooni efektiivsus, nukleiinhapete taastumine ja proovide käitlemine.Optimaalse võrdlusgeeni(de) valimiseks muutsime algoritmi, et võimaldada sellel valida optimaalne võrdlusmeetod sõltuvalt katseseadest.

Sisekontroll
Kontrolljärjestus, mida amplifitseeritakse sihtjärjestusega samas reaktsioonis ja sondeeritakse erineva sondiga (st teostab dupleks-PCR).Ebaõnnestunud võimenduste välistamiseks kasutatakse sageli sisemisi juhtelemente, näiteks kui sihtjärjestust ei tuvastata.
Kalibreerimisproov
Võrdlusproov (näiteks puhastatud RNA rakuliinist või koest), mida kasutatakse suhtelisel kvantifitseerimisel kõigi teiste proovide võrdlemiseks, et määrata geeni suhteline ekspressioonitase.Kalibreerimisproov võib olla mis tahes proov, kuid tavaliselt on see kontroll (näiteks töötlemata proov või proov katse nullajast).

Positiivsed kontrollid
kasutage kontrollreaktsiooneteadaolevates kogustes malli.Positiivseid kontrolle kasutatakse sageli selleks, et kontrollida, kas praimeri komplekt või praimeri-sondi komplekt töötab korralikult ja kas reaktsioon on õigesti seadistatud.

Malli juhtimine puudub (NTC)
Kontrollreaktsioon, mis sisaldab kõiki amplifikatsioonireaktsiooni vajalikke komponente peale malli, mis tavaliselt asendatakse veega.NTC abil saab leida reaktiivi saastumise või võõr-DNA poolt põhjustatud saaste, tagades nii tuvastamisandmete autentsuse ja usaldusväärsuse.NTC kontrolli võimendamine näitab saastumist.

RT kontroll puudub (NRT)
RNA ekstraheerimisprotsess võib sisaldada jääk-genoomset DNA-d, mis on äärmiselt kahjulik ja on andmete kvaliteeti mõjutav süüdlane ja qPCR-i loomulik vaenlane, nii et katsete kavandamisel tuleb see kavandada nii, et see ainult võimendab RNA tuvastamist.On kaks võimalust, üks on praimerite kujundamine intronite vahel, teine ​​on DNA täielik eemaldamine, kumb on parem, millest räägitakse hiljem.NTR-kontroll on maagiline peegel DNA-reostuse tuvastamiseks.Kui on võimendus, tähendab see reostust.

Standardid
Standardid on teadaoleva kontsentratsiooni või koopiaarvuga proovid, mida kasutatakse standardkõvera koostamiseks.Standardi stabiilsuse tagamiseks kloonitakse geenifragment tavaliselt plasmiidi ja kasutatakse standardina.

Standardkõver
tavaliselt lahjendatakse standardtootega vähemalt 5 kontsentratsioonigradiendiks vastavalt kahekordistussuhtele ning CT väärtuse ja koopiaarvu koordinaatidesse tõmmatakse 5 punkti ning punktid ühendatakse, et moodustada standardkõvera loomiseks joon.Iga standardkõvera puhul tuleb kontrollida selle kehtivust.Kalde väärtus jääb vahemikku –3,3 kuni –3,8 ja iga kontsentratsioon viiakse läbi kolmes eksemplaris.Punktid, mis teistest punktidest oluliselt erinevad, tuleks ära visata.Testitava proovi CT väärtus tuuakse standardkõverale ja saab arvutada testitava proovi ekspressioonitaseme.

Testitava proovi CT väärtus tuuakse standardkõverale ja saab arvutada testitava proovi esialgse koopiaarvu.

Tõhusus ja kalle
Standardkõvera kalle näitab reaalajas PCR-i efektiivsust.
·Kalle -3,322 näitab, et PCR amplifikatsiooni efektiivsus on 1 ehk 100% ja PCR produkti kogus kahekordistub igas tsüklis.
·Kalle väiksem kui –3,322 (nt –3,8) näitab PCR-i efektiivsust
· Kui kalle on suurem kui –3,322 (nt –3,0) näitab, et PCR-i efektiivsus näib olevat suurem kui 100%, mis on huvitav, kuidas saaks üks PCR-tsükkel genereerida amplifitseeritud produkti rohkem kui kaks korda?See olukord tekib PCR-reaktsiooni mittelineaarses faasis, see tähendab, et toimub suur hulk mittespetsiifilist amplifikatsiooni.

sulamiskõver
Pärast qPCR amplifikatsiooni lõppu PCR produkti kuumutatakse.Temperatuuri tõustes kaheahelaline amplifikatsiooniprodukt järk-järgult sulab, mille tulemuseks on fluorestsentsi intensiivsuse vähenemine.Teatud temperatuuri (Tm) saavutamisel sulab suur hulk tooteid.Fluorestsents langeb järsult.Erinevatel PCR-i toodetel on erinevad Tm väärtused ja erinevad sulamistemperatuurid, nii et PCR-i spetsiifilisust saab tuvastada.

Sulamiskõver (tuletise kõver)
Sulamiskõver tuletatakse piikide kaardi moodustamiseks, mis võib intuitiivsemalt kuvada PCR-i produkti fragmentide olukorda.Kuna sulamistemperatuur on DNA fragmendi Tm väärtus, saab hinnata mõningaid parameetreid, mis mõjutavad DNA fragmendi Tm väärtust, nagu fragmendi suurus, GC sisaldus jne. Üldiselt võib öelda, et meie praimeri disaini põhimõtete kohaseltamplifitseeritud toote pikkus on vahemikus 80-300 bp, seega peaks sulamistemperatuur olema vahemikus 80 °C kuni 90 °C.

Sulamiskõvera tõlgendamine: Kui ainus põhipiik ilmub vahemikus 80 °C–90 °C, tähendab see, et fluorestseeruv kvantitatiivne PCR on täiuslik;kui põhipiik on vahemikus 80 °C-90 °C ja mitmesugused piigid alla 80 °C, peetakse põhimõtteliselt arvesse praimeri dimeeri.Selle lahendamiseks võite proovida lõõmutamistemperatuuri tõsta;kui põhipiik ilmub vahemikku 80°C-90°C ja mitmesugused piigid ilmuvad uuesti temperatuuri tõustes, siis põhimõtteliselt leitakse, et tegemist on DNA-ga saastumisega ja DNA tuleb katse algfaasis eemaldada.

Muidugi on veel ebanormaalseid olukordi, mida allpool ükshaaval jaotatakse.
3. Täiustatud teadmised

QPCR-i tegemiseks pean ütlema MIQE,Minimaalne teaveavaldamiseksKvantitatiivneReaalajas PCREksperimendid – minimaalne teave reaalajas kvantitatiivse PCR-i käsitlevate artiklite avaldamisekskatsed.Kõigi arusaamise lihtsustamiseks lihtsustame põhisisu.

MIQE originaalteksti saate otsida Internetist ja kõige tähtsam on see, et see sätestaksandmete kontrollnimekiri, mis tuleb esitada artikli avaldamisel .

Ülevaatajad saavad neid üksikasju lugedes hinnata katse kvaliteeti;tulevased lugejad saavad seda kasutada ka katse kordamiseks või täiustamiseks.
Väärib märkimist, et selles loendis on iga loendi tähtsus märgitud vastavalt E või D-ga.Mida see tähendab?E: oluline teave (tuleb esitada);D: soovitav teave (esitage nii palju kui võimalik).

MIQE (1) – eksperimentaalne disain
Paljud pätid, kes on pärast magistriõpingute lõpetamist kaitsmise lõpetanud, ei tea, kuidas iseseisvalt katset kavandada, vihikut avada ja teha seda, mida õpetaja käsib.Seetõttu ei olnud eksperimentaalne kujundus range ja ajakirja toimetus ütles, et nad tahavad seda pilti ja seda pilti välja mõelda, nii et nad tegid seda uimaselt.Nii valmivad pätid!

Kodule lähemal on katse esimene põhimõte kindlaks tehaeksperimentaalse loogika rangus.Kõige põhilisem on katse ülesehitus ja kõige olulisem katseplaani juures on see, kuidas seada sihtvalim, võrdlusproov (kontroll) ja korduste arv, et katseandmed oleksid viidatud, võrreldavad ja veenvad.

Sihtproovviitab proovile, mis nõuab meilt sihtgeeni tuvastamist pärast teatud ravi.Võrdlusnäidison proov ilma igasuguse töötlemiseta, mida bioloogias sageli nimetatakse metsiktüübiks.

Eksperimentaalsed kordusedon väga olulised.Üldiselt peab veenvate korduste arv olema suurem kui kolm.Tuleb eristada, mis on bioloogiline replikatsioon ja mis tehniline replikatsioon.

Bioloogilised replikatsioonid: sama kontrollikatse, mis on tehtud erinevate materjalidega (aeg, taimed, partiid, reaktsiooniplaadid).

Bioloogiline dubleerimine
Võtame näiteks pipra pestitsiididega töötlemise.Tahame pihustada pestitsiide kolmele ABC taimele, siis kolm ABC taime on kolm bioloogilist koopiat ja need on sama kontrollkatse, mis viiakse läbi erinevate materjalidega.Aga eksperimendina on kindlasti vaja tõrjet, nii et saame pritsida taime A ühte haru, et moodustada taime A katserühm, mitte pritsida taime A teisi oksi kontrollrühma moodustamiseks.Tehke sama B ja C puhul.

Tehnilised koopiad (tehnilised koopiad): Tegemist on korduva katsega, mille eesmärk on vältida tööst põhjustatud vigu, mis on tegelikult samas materjalis dubleeritud auk.Nii töötlustel kui ka kontrollidel peavad olema sihtgeeni ja sisemise võrdlusgeeni replikatsiooniseaded (vähemalt kolm).

Tehniline kordus
Võtke jälle näitena pestitsiididega töödeldud pipar.Taime A katserühma jaoks tegime selle sihtgeeni ja sisemise võrdlusgeeni jaoks kolm PCR-i auku 1, 2 ja 3, et võtta pärast tuvastamist keskmine.Taime A tõrjeks käsitletakse ka rühmi samal viisil.Samamoodi töötlege B- ja C-taimi.See on tehniline kordamine.

Väärib märkimist, etstatistikasse siseneb bioloogiline kordus ja tehniline kordamine on selleks, et testida, kas katseprotsessis on juhuslikke nähtusi, et muuta katsetulemused usaldusväärseks, st vältida vigu, võttes nende keskmise, nagu me sageli ütleme.

Negatiivsed kontrollid – NTC ja NRT
NTC (ilma mallita juhtimine), ilma mallita kontrolli, kasutatakse selleks, et kontrollida, kas katsematerjal on saastunud.Üldiselt kasutatakse mallina vett.Kui esineb fluorestsentsreaktsioon, näitab see, et laboris on toimunud nukleiinhappega saastumine.

Need saasteained pärinevad: ebapuhast veest, endogeenset DNA-d sisaldavad kvalifitseerimata reaktiivid, praimerite saaste, laboriseadmete saaste, aerosoolreostus jne, tuleb kasutada RNaasi püüdjaid ja RNaasi inhibiitoreid.Aerosoolreostust on kõige raskem leida.Kujutage ette, et teie labor on nagu sudu, õhus hõljuvad erinevad nukleiinhapped.

NRT (pöördtranskriptaasita), kontroll ilma pöördtranskriptsioonita, on negatiivse kontrollina mitte-pöördtranskribeeritud RNA, mis on gDNA jäägi kontroll.

Geeniekspressiooni tegemisel tuvastatakse RNA kogus cDNA koguse tuvastamisega pärast pöördtranskriptsiooni.Kui RNA puhastamisel esineb gDNA jääk, põhjustab see katsetulemustes vigu, kuna tegelikud tulemused on gDNA ja cDNA.Agregaadi tasemel, mitte ainult cDNA, tuleb RNA ekstraheerimise ajal täielikult eemaldada gDNA.

MIQE (2) – näidisinfo
Nn näidisinfo tähendab, et qPCR-i käsitleva artikli avaldamisel peame näidisinfot selgelt selgitama, mis on artikli asendamatu osa.Samamoodi peame proovide töötlemisel reguleerima ka oma toiminguid, et tagada proovide kehtivus.

Proovi kirjeldus on vaid tulemus ja me peaksime rohkem tähelepanu pöörama kogu katse ajal võetud materjalidele.

Katsematerjalide valik
Vereproovid – vali värske veri, mitte rohkem kui 4 tundi.Rakuproovid – valige värskete rakkude kogumiseks jõulise kasvu perioodil.Loomkude – valige värske, jõuliselt kasvav kude.Taimekude – valige värske, noor kude.

Kindlasti olete märganud, et nendes paaris lauses peitub võtmesõna: värske .
Ülaltoodud proovide jaoks on parim, kulutõhus ja stabiilne komplekt turul Foregene'i komplekt, millega saab kiiresti ja lihtsalt eraldada nende DNA ja RNA.

Vere DNA minikomplekt

Cell Total RNA isolation Kit

Animal Total RNA isolation Kit

Plant Total RNA isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Taime DNA isolatsioonikomplekt

Katsematerjalide ladustamine
Üldiselt ei soovita me proove säilitada, kui tingimused seda võimaldavad.Siiski on palju sõpru, kes ei saa katseid teha kohe pärast proovide võtmist ja mõned peavad isegi vedela lämmastiku mahuteid proovide võtmiseks põllule tassima.

Sellise tööka sõbra kohta võin vaid öelda, et te ei mõista reaktiivi kulumaterjale.Nüüd toodavad paljud reaktiivide tarbimisega tegelevad ettevõtted reagente, mis suudavad säilitada RNA proove toatemperatuuril, ja saate neid kasutada.Tavapärane ladustamismeetod on vedela lämmastiku säilitamine, kasutades väikest vedela lämmastiku paaki, mida on lihtne kaasas kanda.Pärast proovi laborisse toomist hoida seda -80°C külmkapis.

RNA-d hõlmavate katsete puhul tuleb järgida kuue sõna põhimõtet:madal temperatuur, ensüümideta,jakiire .

Madala temperatuuri mõistet on lihtne mõista;ilma ensüümideta on RNaasi kõikjal maailmas, kus me elame (muidu oleks teid HIV tapetud), seega on väga oluline kontseptsioon, kuidas RNaasi katseid tehes vältida;kiire,Maailmas pole Kung Fud, mida ei saaks murda, ainult kiirust ei saa murda.

Seetõttu on teatud mõttes, et mida lühem on ekstraheerimisaeg, seda parem on komplekt.Miks teebForegene'i komplektid rõhutavad kiirust, sest nad teavad seda hästi.

PS: Mõned tüdrukud teevad katseid väga hoolikalt, kuid need pole pärast mitmeaastast tööd nii head kui slam dunk.Nad tunnevad, et Jumal on ebaõiglane, kaebab teiste üle ja otsib elu.Tegelikult ta ei saanud sellest aru.Ta ei kaitsnud RNA-d hästi ja slam dunk mängija oli krapsakas.Eksperimenti tehes arvas ta, et lõpetab slam dunk’i kolm korda, viis korda ja kaks jaotust, kuid ta tegi katse hästi.

Märge: Aeglasem, suurem võimalus RNaasi invasiooniks.Kuidas treenida end kiireks?Ei saa kuidagi, lihtsalt harjuta rohkem.

Erinevate katsete ja erinevate proovide jaoks on siiski vaja lugeda rohkem kirjandust ja valida töötlemiseks sobiv meetod.Proovide kogumise ja säilitamise protsessi jaoks nõuab MIQE, et see peab olema töös selgelt kirjas, et retsensendid saaksid kontrollida paberi usaldusväärsust, samuti on uimastatud noortel mugav teie katset korrata.

Kuigi bioloogilised katsed on keerulised, on need kõrgetasemelised.Kui sa ei ole ettevaatlik, võid maailma ümber lükata.Näiteks SARS-i muutmine biokeemiliseks kriisiks või hübriidriisi valmistamine 1,3 miljardi inimese päästmiseks.Alloleval pildil on keemiakatse, sa peaksid aru saama, kui uhke sa oma uurimistöö üle oled, juba ainuüksi tema riistalaadset välimust vaadates.Unustage see ära, ärge mustage teda.

MIQE (3) – nukleiinhapete ekstraheerimine.
Nukleiinhapete ekstraheerimine on suur sündmus ja kõik molekulaarbioloogia katsed algavad nukleiinhapete ekstraheerimisega.Kõigepealt kopeerime MIQE sisu nukleiinhapete ekstraheerimisel.

Seda vormi vaadates ei saa pinnale jääda.Vorm on dogma.Et olla tippõpilane, tuleb küsida, miks.Selle tabeli põhisisu on järgmineRNA puhtus, terviklikkus, konsistents ja ekstraheerimise kogus .

Esimene osaprotsess või instrument on nukleiinhappe ekstraheerimise etapp.Kui kasutate ekstraheerimiseks automaatset nukleiinhapete ekstraktorit (täpsem, ostmiseks võtke minuga ühendust), peate märkima instrumendi mudelinime.

Komplekti nimi ja

millist komplekti muutuste üksikasjade jaoks kasutati, milliseid spetsiaalseid reaktiive lisati või milliseid eritoiminguid tehti, tuleks selgelt selgitada, et teised saaksid teie katset hõlpsasti korrata.

Mõned inimesed lisavad spetsiaalseid proove ekstraheerides spetsiaalseid reaktiive, arvates, et see on nende salarelv, ega räägi teistele.Seda saladuses hoides kaotavad nad ka võimaluse teie artikkel särama panna.Ära ole tark, sa pead olema teadusuuringutes ausam kui maavana Zhang, kui tahad olla tark, teeb artikkel su lolliks.

peab meeles pidama komplekti tootenumbritkui tellite komplekti ja kirjutate artikli.Tavaliselt on komplektil kaks numbrit: Cat – katalooginumber (tootenumber, artikli number), partii – tootepartii number (kasutatakse näitamaks, millisest partiist toode pärit on).

Lisaks kasutatakse biokeemiliste reaktiivide tellimisel sageli CAS-i numbrit ja populariseerin seda koos.CAS-number on number, mille American Chemical Society annab igale uuele keemilisele ravimile.Tavaliselt on kolm numbrit ühendatud kriipsuga.Rushui CAS-number: 7732-18-5.Kemikaalidel on sageli mitu varjunime, kuid CAS-number on kordumatu.Ravimit tellides saate esmalt kontrollida selle CAS-numbrit.

Kodule lähemal, miks me peame neid asju selgelt kirjeldama?Tegelikult on see ka RNA ekstraheerimise kvaliteedi kontrollimiseks.Instrumentide ja komplektide kasutamine muudab RNA ekstraheerimise järjepidevamaks.Tavaliste laborite ekstraheerimisskaala pole suur ja seda saab komplektidega.

DNaasi või RNaasi ravi üksikasjad
Fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-i oluline küsimus on DNA saastumise vältimine ja saastumise korral ärge katsetage.Seetõttu on hädavajalik märkida ära protsess, mida kasutasite DNA töötlemiseks, et näidata, et katseprotsessis olev DNA on täielikult ja täielikult eemaldatud.kujutatud skemaatilise diagrammiga.

RNA ja DNA skemaatiline diagramm
Üldiselt on DNA eemaldamise meetod RNA töötlemine pärast ekstraheerimist DNaasiga.Need on aga suhteliselt vanad meetodid.Kaubanduslikud RNA ekstraheerimiskomplektid on suutnud DNA ekstraheerimise käigus eemaldada ilma DNaasi lisamata.Näiteks Foregene komplektide seeria.

Märge: DNA eemaldamine RNA ekstraheerimise käigus on väga ohtlik kahe teraga mõõk, mis pikendab RNA ekstraheerimise tööaega ja suurendab RNA lagunemise ohtu.Põhimõtteliselt on see kompromiss RNA saagise ja puhtuse vahel.

Lisaks on ränidioksiidil põhinevasse adsorptsioonikolonni lisatud DNaasi kogus väga väike ning efekti saavutamiseks tuleb kasutada kvaliteetset DNaasi.Optimeerimata DNaasi ei saa kiiresti ja täielikult seedida.See on kaupmehe tehnilise taseme test.Muidugi on veelgi veidramaid kaupmehi, kes uhkeldavad, et DNA-d saab eemaldada ilma DNaasita.Võib öelda, et igaüks, kes kiitleb, et DNA-d saab täielikult eemaldada ilma DNaasita, on huligaan.DNA on suhteliselt stabiilne kaheahelaline struktuur ja seda ei saa lihtsalt rääkimise ja naermisega hävitada.

Saastumise hindamine
hindamismeetod: elektroforeesi tuvastamine, 1% agaroos, 6V/cm, 15 min, laadimine 1-3 ul

Nukleiinhapete kvantitatiivne analüüs
Tavaliselt mõõdetakse UV-spektrofotomeetriga.Lubage mul esmalt populariseerida kolme väärtuse OD260, OD280 ja OD230 tähendust.
·OD260nm: see on nukleiinhappe kõrgeima neeldumispiigi neeldumislainepikkus ja parim mõõdetud väärtus jääb vahemikku 0,1–1,0.Kui ei, lahjendage või kontsentreerige proov, et viia see vahemikku.
·OD280nm: see on valkude ja fenoolsete ainete kõrgeima neeldumispiigi neeldumislainepikkus.
·OD230nm: see on süsivesikute kõrgeima neeldumispiigi neeldumislainepikkus.

Järgmisena räägime iga näitaja rollist.A260 puhul saab seda kasutada nukleiinhappe saagise mõõtmiseks.Kui OD260 = 1, dsDNA = 50 μg/ml, ssDNA = 37 μg/ml, RNA = 40 μg/ml.

Puhtuse tagamiseks peame vaatama suhteid, mida tavaliselt näeme: OD260/280 ja OD260/230.
·Puhas DNA: OD260/280 on ligikaudu võrdne 1,8-ga.Kui see on suurem kui 1,9, näitab see RNA-reostust ja kui see on alla 1,6, näitab see valgu- ja fenoolireostust.
·Puhas RNA: 1,7
·OD260/230: olenemata sellest, kas see on DNA või RNA, on kontrollväärtus 2,5.Kui see on alla 2,0, näitab see suhkru, soola ja orgaanilise aine reostust.

RNA terviklikkus

Väga oluline on mõõta RNA terviklikkust.Üldiselt on vaja teha RNA denaturatsioonigeeli katse, et kontrollida, kas 28S ja 18S RNA heledus on kahekordne.Kui ilmub kolmas riba 5S, tähendab see, et RNA on hakanud lagunema, välja arvatud selgrootute puhul.

Andmed RNA kvaliteedi hindamiseks: Lisaks ülaltoodud testidele on olemas ka mõned RNA terviklikkuse osas arenenumad instrumenditestid, näiteks Experioni automaatse elektroforeesisüsteemi RQI terviklikkuse test, mis suudab tuvastada, kas RNA laguneb nähtamatult.

Teadusuuringutes on fluorestsents-kvantitatiivne PCR sihtgeeni ja sisemise võrdlusgeeni võrdlus.Seetõttu on RNA proovide säilitamise, RNA ekstraheerimise jne protsessis esmane eesmärk tagada RNA terviklikkus.

Kuidas RNA terviklikkus mõjutab tasakaalu sihtgeeni ja sisemise võrdlusgeeni vahel, saab hõlpsasti aru allolevalt jooniselt.Lagundamine toob kaasa geeni ebatäielikkuse, olgu see siis sisemise võrdlusgeeni puudulikkus või sihtgeeni mittetäielikkus, sellel on andmetele suur mõju.

Sihtgeeni ja võrdlusgeeni skemaatiline diagramm ei tohi olla tõene

Inhibeerimise test (kas CT väärtus on alla surutud kõrge või madala kontsentratsiooni või muudes tingimustes)

Selle joonise näitel on viie kõvera Ct väärtused järgmised.CT väärtuste jaotus kõverate vahel on ebaühtlane ja Ct väärtused hilinevad kõrge ja madala kontsentratsiooni korral, mis on PCR inhibeerimise puhul.

Põhipunkt: RNA ekstraheerimise protsessis peame loobuma väärarusaamadest ja looma õiged.

Vale idee on: RNA ekstraheerimine taotleb ainult saagist, arvates, et mida suurem on saadud RNA kogus, seda parem.Tegelikult, kui me kvantifitseerime, siis kui geenide arv ei ole väga suur, ei vaja me palju RNA-d.Ekstraheeritava RNA kogus on enam kui piisav.

Õige kontseptsioon on järgmine:RNA ekstraheerimine peaks järgima puhtust, terviklikkust ja järjepidevust.Puhtus võib tagada, et järgnevat pöördtranskriptsiooni ei inhibeerita ja DNA ei mõjuta andmeid.Terviklikkus tagab sihtjadade ja sisemiste viidete tasakaalu.Järjepidevus tagab proovi stabiilse laadimise.

MIQE (4) – pöördtranskriptsioon
Vale arusaam: püüdlus suurema proovimahu poole.
Õige kontseptsioon: taotleda järjepidevust (stabiilsust), olenemata laaditud RNA kogusest, jääb pöördtranskriptsiooni efektiivsus järjepidevaks, tagades, et erinevused cDNA-s võivad tõepoolest kajastada mRNA erinevusi.
Selgitame seda protsessi skemaatilise diagrammi abil:

Pöördtranskriptsiooni efektiivsuse skemaatiline diagramm ei vasta tõele
Esiteks peame mõistma erinevust pöördtranskriptsiooni protsessi ja PCR protsessi vahel.PCR läbib mitu kuumutamis- ja anniilimisprotsessi ning sihtfragment kasvab eksponentsiaalselt;Kuigi pöördtranskriptsioonil seda protsessi ei ole, võime ette kujutada, et pöördtranskriptsioon on tegelikult üks-ühele Replikatsiooniprotsessi ajal on palju RNA tükke

kuna on võimalik saada nii palju cDNA informatsiooni tükke, peaks sellest praeguseks aru saama, sest suured ja väikesed fragmendid on pöördtranskribeeritud ning ühele fragmendile keskenduda on võimatu.Ja kuna RNA kogus on suhteliselt väike, siis erinevalt PCR-ist, millel on amplifikatsiooniefekt, on ka saadud cDNA kogus suhteliselt väike, seega on seda põhimõtteliselt võimatu tuvastada.

cDNA elektroforeesi tulemused
Teiseks, ideaaljuhul tehakse pöördtranskriptsioon üks-ühele, kuid ükski firma pöördtranskriptaas ei suuda seda efekti saavutada.Põhimõtteliselt jääb enamiku pöördtranskriptaaside efektiivsus 30-50% vahele.Sel juhul sooviksime pigem suhteliselt stabiilset pöördtranskriptsiooni efektiivsust, mida me joonisel näha tahame: 3 RNA-d saavad 2 cDNA-d, 6 RNA-d 4 cDNA-d, nii et olenemata sellest, kui palju proovi on laaditud, on pöördtranskriptsiooni efektiivsus suhteliselt stabiilne.Me ei taha näha olukorda, kus pöördtranskriptsiooni efektiivsus on ebastabiilne ja kõrge kontsentratsioon on inhibeeritud.

Niisiis, kuidas kontrollida, kas pöördtranskriptsiooni efektiivsus on stabiilne?Meetod on väga lihtne, tuleb teha vaid võrdlustest: üks on pöördtranskribeerimine cDNA-ks pärast RNA kahekordistamist ja teine ​​on pärast cDNA-ks pöördtranskribeerimist kahekordistada ning seejärel teha qPCR, et näha saadud kalle Kas see on ühtlane.Tippõpilasena peaksite sellest aru saama sekunditega.Nagu allpool näidatud:

RNA ja cDNA lahjendamine, et testida, kas pöördtranskriptsiooni efektiivsus on stabiilne
Pöördtranskriptaas ja komplekt
Kuidas saab täiuslikul fluorestsents-kvantitatiivsel PCR-il olla suurepärane pöördtranskriptaas ja komplekt.Pöördtranskriptaas jaguneb allika järgi laias laastus kahte tüüpi, AMV võiM-MLVja nende toimivus on sama, mis tabelis näidatud.

RNaasi H aktiivsus
RNaas H on ribonukleaas H, hiina nimi on ribonukleaas H, mis on endoribonukleaas, mis suudab spetsiifiliselt hüdrolüüsida RNA-d DNA-RNA hübriidahelas.RNaas H ei saa hüdrolüüsida fosfodiestersidemeid ühe- või kaheahelalises DNA-s või RNA-s, see tähendab, et see ei saa seedida ühe- või kaheahelalist DNA-d või RNA-d.Tavaliselt kasutatakse cDNA teise ahela sünteesiks.

See on imelik asi.Me ütleme, et pöördtranskriptaasil on RNaas H aktiivsus, mitte et pöördtranskriptaas sisaldab RNaas H, ja RNaasi H eraldamine pöördtranskriptaasist ei pruugi olla võimalik, võib-olla teatud rühmade konformatsiooni tõttu pöördtranskriptaasis. Selle aktiivsuse põhjustab pöördtranskriptaas.

Seetõttu, olenemata AMV kõrgemast pöördtranskriptsiooni efektiivsusest, vähendab selle RNaasi H aktiivsus cDNA saagist.Loomulikult optimeerivad reaktiivide tootjad pidevalt oma tooteid, et kõrvaldada RNaasi H aktiivsus pöördtranskriptaasis nii palju kui võimalik, et suurendada cDNA saagist.
Lõõmutamise temperatuur

RNA sekundaarne struktuur erinevatel temperatuuridel
Vaadake ülaltoodud joonist RNA sekundaarse struktuuri kohta erinevatel temperatuuridel ja kasutage mFoldi võrgutööriista, et määrata sihtfragmendi sekundaarne struktuur konkreetsetel temperatuuri- ja soolakontsentratsioonitingimustel.Temperatuuril 55 ° C on RNA sekundaarstruktuur endiselt väga keeruline, pöördtranskriptaas ei saa töötada ja sekundaarne struktuur ei saa täielikult lahustuda enne 65 ° C, samas kui AMV ja M-MLV optimaalne temperatuur on sellest temperatuurist palju madalam.
mida teha?Sekundaarne struktuur on malli enda täiendav sidumine, mis põhjustab tugevat konkurentsi praimeri ja pöördtranskriptaasi ning malli vahel, mille tulemuseks on rida probleeme, nagu madal E ja halb korratavus.

mida teha?Suurendage ainult lõõmutamistemperatuuri nii palju kui võimalik.

Paljud reaktiivide tootjad täiustavad oma pöördtranskriptaasi geenitehnoloogia abil.Mõned suurendavad reaktsiooni temperatuuri, näiteks Jifan ja Aidelai, ja mõned eemaldavad ensüümi RNaas H aktiivse rühma, et parandada ensüümi ja RNA matriitsi vahelist afiinsust.Kõrge afiinsus võib konkureerivalt sekundaarse struktuuri välja pigistada ja sujuvalt läbi lugeda ning samuti oluliselt parandada pöördtranskriptsiooni tõhusust.
Võtmepunkt: Pöördtranskriptsioon on olulisem pöördtranskriptsiooni efektiivsuse järjepidevuse saavutamiseks (ensüümid ei pea olema mitte ainult tõhusad, vaid ka stabiilsed), mitte laaditud proovi kogus, kui tegemist pole eriti suuremahulise fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-iga, pole see üldse võimalik.Mitu cDNA-d.
Ka erinevad tootjad on järjepidevuse nimel pingutanud.Näiteks on enamik ettevõtteid nüüd pakkinud pöördtranskriptsiooni müügiks standardkomplektina, mis on hea valik.
Näiteks Foregene RT Easy Series komplektid:

RT Easy I (esimese ahela cDNA sünteesikomplekti põhiline eelsegu)

MIQE (5) – sihtgeeni informatsioon

Ülaltoodud joonis selgitab
1. Seda, kas see geen on korduvate katsete jaoks tõhus, saab üldiselt kontrollida korduvate katsetega.
2. Geeni ID, tead küll.
3. Geeni pikkus, sihtgeeni kogupikkus pole kindlasti probleem.Praimerite kavandamisel veenduge, et amplikoni pikkus oleks vahemikus 80-200 bp, et tagada parem võimenduse efektiivsus.
4. Sequence Blast võrdlusteave, sihtgeeni tuleb geenipangas võrrelda, et vältida mittespetsiifilist amplifikatsiooni.
5. Pseudogeenide olemasolu.Pseudogeen on DNA järjestus, mis sarnaneb normaalse geeniga, kuid kaotab oma normaalse funktsiooni.See esineb sageli eukarüootide mitme geeniga perekonnas.Tavaliselt tähistatakse seda ψ-ga.See on genoomis olev mittefunktsionaalne genoomse DNA koopia, mis on väga sarnane kodeeriva geenijärjestusega., ei ole üldjuhul transkribeeritud ja neil puudub selge füsioloogiline tähendus.
6. Praimerite asukoht eksonite ja intronite suhtes.Algusaastatel, kui lahendasime DNA saastumise probleemi, pöörasime sageli tähelepanu praimerite, eksonite ja intronite positsioonidele ning üldiselt kaalusime praimerite kavandamist intronite vahel, et vältida DNA amplifikatsiooni.Vaadake allolevat joonist: must tähistab introneid, mitmesugused sinised tähistavad eksoneid, roosa tähistab tavalisi praimereid ja erepunane tähistab intronit hõlmavaid praimereid.

Skemaatiline, pole kunagi tõsi
Kui täiuslik plaan see tundub, kuid tegelikult pole trans-introni praimerid enamikul juhtudel nii maagilised, kui ette kujutatakse, ja need põhjustavad ka mittespetsiifilist võimendust.Seega on parim viis DNA saastumise vältimiseks eemaldada DNA täielikult.
7. Konformatsiooni ennustamine.Seda näidet uuesti kasutades kasutage mFoldi võrgutööriista, et määrata sihtfragmendi sekundaarne struktuur kindlal temperatuuril ja soola kontsentratsioonil.

RNA sekundaarne struktuur erinevatel temperatuuridel
Sekundaarne struktuur on malli enda täiendav sidumine, mis toob kaasa tugeva konkurentsi praimeri ja malli sidumise vahel ning praimeri sidumise tõenäosus on väiksem, mille tulemuseks on rida probleeme, nagu madal E ja halb korratavus.Tarkvara ennustamise kaudu oleks see suurepärane, kui sekundaarse struktuuri probleemi pole.Kui see on olemas, arutatakse meie järgmises artiklis konkreetselt, kuidas seda probleemi lahendada.

MIQE (6) – qPCR oligonukleotiidid

Fluorestsents-kvantitatiivse PCR puhul on esimene asi, millega iga päev vaeva näed, RNA ekstraheerimine ja teine ​​asi võib olla praimeri kujundamine.
Kõigepealt kontrollime ikkagi krundi kujundamise reegleid vastavalt MIQE kontrollnimekirjale.See on nii lihtne, et pätid saavad naerda ja me saame selle ühe lausega lõpetada: uurige praimeri sondi järjestust ja asukohta ning muutmismeetodit.Praimeri puhastamise meetodi puhul on praimeri süntees praegu nii odav, qPCR väärib PAGE ja kõrgemaid puhastusmeetodeid ning sünteesiseadme teave pole oluline.Paljud inimesed on praimereid teinud aastakümneid ega tea, et süntesaatoriks on ABI3900.
Mis puutub aabitsakujunduse põhimõtetesse, siis ei pea neid pähe õppima, sest nende probleemidega saab hakkama enamik aabitsate kujundamise tarkvara või veebitööriistu (soovitatav veebitööriist primer3.ut.ee/) ning 99,999% krundikujundusest ei tehta käsitsi Vaata, autor kujundab vahel sadu krunte päevas, kui ükshaaval läbi lugeda, siis läheb see läbi.
Pärast praimerite kavandamist kontrollige lihtsalt järgmisi punkte:
1. Kujundage praimerid 3'-otsa lähedal: kui kasutate cDNA esimese ahela sünteesiks oligo-dT-praimereid, tuleb kavandatud praimerid, võttes arvesse pöördtranskriptsiooni efektiivsust ja RNA terviklikkust, konstrueerida 3'-otsa lähedale, et parandada amplifikatsiooni efektiivsust.Kasutage pilti, et selgitada järgmiselt (sellest ei saa kuidagi aru):

Miks peaks praimerid olema konstrueeritud 3′ otsa lähedale, see ei tohi olla tõsi
2. TM väärtus: Tm väärtus on 55–65 °C (kuna eksonukleaasi aktiivsus on kõrgeim temperatuuril 60 °C) ja GC sisaldus on 40–60%.
3. BLAST: genoomi mittespetsiifilise amplifikatsiooni vältimiseks tuleb täiendavaks kontrollimiseks kasutada Blasti.

MIQE(7) – qPCR protsess

1. qPCR komplekt
Vastavalt MIQE nõuetele peame artiklis selgelt kirjeldama täielikke reaktsioonitingimusi, sealhulgas PCR reaktsioonisüsteemi konfiguratsiooni, millist komplekti kasutatakse, kes on tootja, kui suur on reaktsioonisüsteem, kas kasutatakse värvimismeetodit või sondi meetodit, PCR programmi sätteid.Veteranjuhid leiavad kindlasti, et seni, kuni komplekt on valitud, on ülaltoodud teave põhimõtteliselt kindlaks määratud.
Praegu on fluorestseeruvate kvantitatiivsete PCR-komplektide tootmine ja tootmine väga arenenud tehnoloogia.Niikaua kui te ei vali väga halbu tootjaid, pole probleemide tõenäosus suur, kuid siiski tahame teiega jagada mõnda punkti:
Kuumkäivitus Taq ensüüm:PCR-i kõige olulisem osa on kuumkäivitusega Taq ensüüm.Turul olevad kuumkäivitusensüümid jagunevad üldiselt kahte tüüpi, millest üks on keemiliselt modifitseeritud kuumkäivitusensüüm (võite seda ette kujutada parafiini manustamisena) ja teine ​​on kuumkäivitusega ensüüm antikehade modifitseerimiseks (antigeeni-antikeha sidumine).Keemiline modifitseerimine on ensüümide kuumkäivitamise varajane viis.Teatud temperatuuri saavutamisel vabastab ensüüm oma aktiivsuse.Antikehaga modifitseeritud kuumkäivitusensüüm kasutab ensüümi aktiivsuse blokeerimiseks bioloogilisi meetodeid.Teatud temperatuuri saavutamisel denatureeritakse ja inaktiveeritakse antikeha valguna ning ensüümi aktiivsus võetakse mängu.

Samas, mis sellest kasu on?See on nii, antikehadega modifitseeritud ensüümide vabanemisaktiivsus on kiirem kui keemiliselt modifitseeritud ensüümidel, seega tundlikkuse osas on antikehaga modifitseeritud ensüümidel väike eelis, mistõttu turul olevatest komplektidest keemiliselt modifitseeritud ensüüme põhimõtteliselt ei leidu.Kui on, siis on selle tootja tehnoloogia endiselt aastatuhande ajastus kinni.
Magneesiumioonide kontsentratsioon:Magneesiumiioonide kontsentratsioon on PCR reaktsioonis väga oluline.Sobiv magneesiumioonide kontsentratsioon võib soodustada Taq ensüümi aktiivsuse vabanemist.Kui kontsentratsioon on liiga madal, väheneb ensüümi aktiivsus oluliselt;kui kontsentratsioon on liiga kõrge, suureneb ensüümi katalüüsitud mittespetsiifiline amplifikatsioon.Magneesiumiioonide kontsentratsioon mõjutab ka praimerite anniilimist, matriitsi ja PCR-produktide sulamistemperatuuri, mõjutades seeläbi amplifitseeritud fragmentide saagist.Magneesiumiioonide kontsentratsiooni kontrollitakse tavaliselt 25 mM juures.Muidugi, hea komplekti jaoks peab magneesiumiioonide kontsentratsioon olema hästi kontrollitud.Mõned kaupmehed lisavad reaktiivile magneesiumiioonide kelaativat ainet, mis võib saavutada magneesiumiioonide kontsentratsiooni automaatse reguleerimise.
Fluorestseeruva värvaine kontsentratsioon:Fluorestsentsvärv, mis on SYBR Green, mida me tavaliselt kasutame, genereerib peamiselt fluorestsentsi, seondudes kaheahelalise DNA väiksema soonega, kuna värvaine seondumine kaheahelalise DNA-ga on mittespetsiifiline, see tähendab, et seni, kuni sellega kombineeritakse kaheahelalist DNA-d, võib tekkida fluorestsents, nii et süsteemis moodustuvad praimer-dimeeride taustasignaalid.
PS: Tänu oma valgustundlikele omadustele on turul olevad tooted üldiselt pakendatud pruunidesse läbipaistmatutesse tsentrifuugitorudesse (nagu on näidatud alloleval pildil).Sellega kaasneb aga probleem.Proovi võtmisel on raske näha, kas vedelikku imetakse.Selles osas on Qingke tõepoolest kõige kasutajasõbralikum (nagu alloleval pildil näha) ning läbipaistev toru on pakendatud läbipaistmatusse plekkkotti.Seejärel pange see plekkkotti, võttes arvesse valguse vältimise ja proovide võtmise mugavust.Peate valima õige tootenumbri.TSE204 on ülimalt kuluefektiivne olemasolu, mis tekitab minus soovi muru istutada.

Väga oluline on ka fluorestseeruva värvaine kontsentratsioon.Kui kontsentratsioon on liiga madal, ei tõuse amplifikatsioonikõver hilisemas etapis ega ole täiuslik;kui kontsentratsioon on liiga kõrge, põhjustab see mürahäireid.Kuna fluorestsents-kvantitatiivne PCR sõltub peamiselt CT väärtusest, siis kui fluorestseeruva värvaine kontsentratsiooni ei reguleerita õigesti, on madalpunkt parem kui kõrgpunkt.Loomulikult on sobivaim värvaine kontsentratsioon.

ROX: ROX-värve kasutatakse hästi süvendisse fluorestsentssignaali vigade parandamiseks.Mõned instrumenditootjad nõuavad kalibreerimist, teised aga mitte.Näiteks Thermo Fisher Scientificu reaalajas PCR-võimendusseadme kasutamine nõuab tavaliselt kalibreerimist, sealhulgas 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus jne. Seda kirjeldavad komplekti üldised juhised.
Foregene qPCR Mix sisaldab ka ROX-värvi, mida on mugav kasutada erinevates mudelites.

Reaalajas PCR Kit-Taqman

Nõrga vesiniksideme töötlemine: Nõrkade vesiniksidemete töötlemine on suhteliselt tehniline küsimus.Paljude komplektide juhendeid pole miski lugenud, kuid ükski neist ei maininud seda teemat.Tegelikult on see nii oluline.Aluste kombinatsioon sõltub peamiselt vesiniksidemete tugevusest.Tugevad vesiniksidemed on normaalne amplifikatsioon ja nõrgad vesiniksidemed põhjustavad mittespetsiifilist võimendust.Kui nõrku vesiniksidemeid ei saa hästi kõrvaldada, ei saa vältida mittespetsiifilist amplifikatsiooni.Autori piires on seda probleemi märganud vaid vähesed ettevõtted.Komplekti ostes võite viidata sellele, kas olete kaalunud selles osas lahendust selle komplekti puhul, mida soovite valida.

Reaktsiooni maht: 20–50 ul süsteemi kasutatakse sagedamini ja väiksemad mahud põhjustavad tõenäoliselt vigu.Üldiselt soovitatakse komplekti juhistes kasutada PCR reaktsiooni mahtusid.Ära ole tark ja kasuta kulude kokkuhoiuks väiksemaid mahtusid.eesmärk.Kaupmeeste soovitatud maht on reaalselt testitud ja võib juhtuda, et nad ei suuda väikestest kogustest tingitud vigade probleemi lahendada.
2. Toruplaadi tootja ja tootenumber
Kõik teavad fluorestsents-kvantitatiivse PCR-i põhimõtet.Fluorestsentsi kogumine toimub peamiselt PCR-tuubi korkide kaudu.PCR-i kulumaterjalide valimisel pöörake tähelepanu kahele punktile: hea valguse läbilaskvus ja instrumendile sobiv.Üldjuhul on peavoolubrändide lauad ja torud korras, aga kohandamise osas tuleb hoolikalt valida, muidu ei saa pilli kasutada.

4. Tipptasemel teadmised

MIQE (8) – qPCR valideerimine
See on qPCR-i peamine prioriteet!Nii mõnigi kangelane on siin liiva sisse kukkunud.Muidugi on ka võimalik, et sul veab ja uuritud geenid on lihtsad, nii et hõljusid mööda tuult läbi jääkoopa.qPCR-i kontrollteave on mõeldud andmete usaldusväärsuse testimiseks.Loetleme vajaliku kinnitusteabe järgmiselt:

1. Spetsiifilisuse test
Sihtgeeni amplifikatsiooni spetsiifilisust testitakse, kontrollides, kas elektroforeesi pilt on üks riba;järjestuse kontrollimine;sulamiskõver, et näha, kas piigikaart on üksik;ensüümi seedimise kontrollimine ja muud meetodid.
Siin keskendume tmittespetsiifilise amplifikatsiooni analüüs sulamiskõverate meetodil.Üldiselt on praimerite kujundamisel nõutav tootefragmendi suurus vahemikus 80-200 bp, mis muudab PCR-i produkti sulamistemperatuuri vahemikku 80-85 °C.Seega, kui esineb mitmesuguseid piike, peavad olema ka muud mittespetsiifilised amplifikatsiooniproduktid;kui piik ilmub alla 80 °C, peetakse seda üldiselt praimeri dimeeriks;kui tipp on üle 85°C, peetakse seda üldiselt DNA saastumiseks või suuremateks fragmentide mittespetsiifiliseks amplifikatsiooniks.
Märkus. Mõnikord on 80 °C juures ainult üks tipp.Praegu tuleb sellest kontseptsioonist kinni pidada.Tõenäoliselt on amplifikatsiooni tulemused kõik praimeri dimeerid.

Tavaline sulamiskõver (üks piik ilma mittespetsiifilise võimenduseta)

Probleemne sulamiskõver (eksitavate piikide mittespetsiifiline võimendamine)
【Juhtumi analüüs】

Peamine tipp on olemas, kuid praimeri dimer on tõsine
Alloleval joonisel olev ühe tipuga sulamiskõver võib teie silmi kergesti petta, arvates, et tegemist on täiusliku katsega, kuid tulemus on täiesti vale.Sel ajal peame vaatama sulamistemperatuuri.Tipptemperatuur on alla 80°C, mis on täielikult praimer-dimer.

Sihtfragment puudub, kõik praimeri dimeerid
Siin ei saa mu vend peatuda.Alloleval pildil on mobiiltelefoniga tehtud foto, mille saatis mulle pätt.Tema kasutatud reaktiivid on kõik selles valdkonnas levinud kaubamärgid.Ta muutus ühelt T-prefiksi kaubamärgilt teisele T-prefiksi kaubamärgile.Ma arvan, et sa oled seda juba arvanud.Kaabukas nuttis mulle: „Esimesel pildil kasutatud reaktiiv on liiga hea ja tipp on üksik.Hiljem, pärast teie soovitatud reaktiivi kasutamist, muutub see nagu teisel pildil, segatud piigid.Sa oled mind õnnetuks teinud.“
Eraldage kaks graafikut.Esmapilgul on ühel üks ja teisel topelttipp.Jama, üks tipp on muidugi hea.Kas see on tõsi?
Hullem kui Dou E, kui panen kaks pilti allolevale pildile, siis saate kohe aru.Tegelikult oleme sellisest pildist kergesti halvatud.Pärast hoolikat analüüsi avastasime, et: esimese joonise tipp on 75°C juures, mis on täielikult praimeri dimeer;teise joonise tipp ilmub 75°C ja 82°C juures, vähemalt seal on Toode ilmub.

Pilte õpilaste tagasisidest
Seega pole põhiprobleem mitte reagentide, vaid praimeri kujundamise probleem.Samas tõestab see ka seda, et mõned suured kaubamärgid ei ole raua kvaliteediga, ja see tõestab ka seda, mida mu vend enne ütles: Teie artiklit ei toeta reaktiivi bränd.See on teie artikkel, mis toetas reaktiivide kaubamärki.Kujutage vaid ette, kui rämps reaktiive ei vahetaks, saadetakse päevikusse valed andmed ja see, mis juhtuks, oleks tragöödia.
2. Tooriku kontrolli Ct väärtus
Ärge seletage, kui tühja kontrollil on Ct väärtus, kas see pole reostus?Siiski peate ikkagi aru saama, millisel tühja juhtelemendil on Ct väärtus.Kui see on NTC, tähendab see, et seal on võõr-DNA, näiteks reaktiivi saastumine.Kui see on NRT, tähendab see, et ekstraheeritud RNA-l on DNA saastumine.
3. Standardkõver
Kaasa arvatud kalle ja arvutusvalem, saab PCR-i efektiivsust arvutada valemi kaudu.Täiuslik katse nõuab, et standardkõvera kalle läheneks 3,32-le ja R² läheneks 0,9999-le.
4. Lineaarne dünaamiline ulatus
Reaktsiooni dünaamiline ulatus on lineaarne.Vastavalt standardkõvera genereerimiseks kasutatud mallile peaks dünaamiline vahemik hõlmama vähemalt 5 kontsentratsioonigradienti ning pöörama tähelepanu Ct väärtuste muutumisele kõrge kontsentratsioonigradienti ja madala kontsentratsioonigradienti korral.
5. Tuvastamise täpsus
Muutused qPCR tulemustes, st halb korratavus, st halb täpsus, on põhjustatud paljudest teguritest, sealhulgas temperatuurist, kontsentratsioonist ja toimimisest.qPCR täpsus muutub üldiselt vähem kontrollitavaks, kui koopiate arv väheneb.Ideaalis katsesisese variatsiooni korral peaks see tehniline varieeruvus olema erinev bioloogilisest variatsioonist ja bioloogilised kordused võivad otseselt käsitleda qPCR tulemuste statistilisi erinevusi rühmade või raviviiside vahel.Eelkõige diagnostiliste analüüside puhul tuleb esitada parim katsetevaheline täpsus (kordatavus) kohtades ja operaatorites.
6. Tuvastamistõhusus ja LOD (mitmekordne qPCR)
LOD on madalaim 95% tuvastatud positiivsete proovide kontsentratsioon.Teisisõnu ei tohiks sihtgeeni replikaatide komplektis sisalduv LOD kontsentratsioon ületada 5% ebaõnnestunud reaktsioonidest.Mitmekordse qPCR analüüsi tegemisel, eriti punktmutatsioonide või polümorfismide samaaegseks tuvastamiseks, peab multipleksne qPCR andma tõendeid selle kohta, et mitme sihtmärgifragmendi täpsus ei ole samas katseklaasis ohus, mitmekordse tuvastamise ja ühe katseklaasi tuvastamise efektiivsus ja LOD peaksid olema samad.Eriti kui kõrge kontsentratsiooniga sihtgeene ja madala kontsentratsiooniga sihtgeene korraga amplifitseeritakse, tuleb sellele probleemile tähelepanu pöörata.
Probleemid ja lahendusedÜldiselt keskenduvad qPCR-i silumisel sageli esinevad probleemid järgmistele aspektidele:
·mittespetsiifiline võimendus
·Keeruline praimeri kontsentratsiooni valik ja hädas praimer-dimeeridega
· Lõõmutustemperatuur on ebatäpne
· Sekundaarne struktuur mõjutab võimenduse efektiivsust
mittespetsiifiline amplifikatsioon
mittespetsiifiline võimendusesineb , siis üldiselt mõeldakse, kas krundi kujundus ei sobi, aga kui te ei kiirusta kruntvärvide vahetamisega, võite esmalt proovida järgmisi meetodeid (põhimõte on ka lisatud):
·Tõstke lõõmutamistemperatuuri – püüdke muuta nõrgad vesiniksidemed säilimisvõimetuks;
·Lühendage lõõmutamis- ja pikenemisaega – vähendage nõrkade vesiniksidemete tekkimise võimalust;
·Vähenda praimeri kontsentratsiooni – vähenda üleliigsete praimerite ja mittesihtpiirkondade seondumise võimalust;
Madal võimenduse efektiivsus
Vastupidine olukord mittespetsiifilisele võimendusele – madal võimendusefektiivsus ja meetmed madala võimendusefektiivsusega tegelemiseks on just vastupidised:
· Pikendage lõõmutamise ja pikenemise aega;
·Mine üle kolmeastmelisele PCR-ile ja vähenda anniilimistemperatuuri;
·Suurendage praimeri kontsentratsiooni;
Ps: Paljud 90ndatel sündinud kraadiõppurid ei soovi uurida, kuidas katseid siluda, ja loodavad, et komplekt suudab probleemi täielikult lahendada (kui soovite pärast kooli lõpetamist minna reaktiivifirmasse teadus- ja arendustegevust tegema), tegelikult mõtlevad ka reaktiivide tootjad nii, ma loodan, et see on loll. Seda saab kasutada, kui saate selle kätte, nii et palju reaktiivitootjate jõupingutusi, sealhulgas nõrkade tootjate jõupingutusi, lahendada. -sidemete neeldumistegurid.Probleemi lihtsaks lahendamiseks peavad lollid ikka lugema reaktiivifirma tutvustust, et näha, kas seal on tegur, mis nõrgemaid vesiniksidemeid neelab.
Keeruline praimeri kontsentratsiooni valik ja hädas praimer-dimeeridega
1. meetod: Üldiselt on qPCR-i komplekti juhistes soovitatavad süsteemid ja soovitatavad praimerite kontsentratsioonid.
2. meetod: Silumine praimeri kontsentratsiooni gradiendi määramisega.Allolev pilt on illustreerimiseks ühest ettevõttest varastatud.Alloleval joonisel on näidatud fluorestsentsi kvantitatiivsed tulemused, mis on saadud kolme praimeri kontsentratsioonigradienti (100 nM, 250 nM, 500 nM) ja nelja matriitsi kontsentratsioonigradienti (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng) abil.Katsetulemuste Ct väärtus joonistatakse järgmiselt:

Praimeri kontsentratsiooni valimine Ühendage iga praimeri kontsentratsioon jooneks järgmiselt:

Praimeri kontsentratsiooni valik on ilmne, praimeri kontsentratsioonide 100 nM ja 250 nM lineaarne seos on parem ning 500 nM praimeri kontsentratsiooni lineaarne seos on suhteliselt halb.100 nM ja 250 nM puhul on Ct väärtus 250 nM suhteliselt väike, seega on praimeri optimaalne kontsentratsioon 250 nM.Üldiselt võib sulamiskõveral näha tugevaid praimer-dimeere.Mis siis, kui kavandatud praimerid ei saa praimer-dimeere vältida?
3. meetod: Vähendage praimerite kogust ja tõstke anniilimistemperatuuri (pole vaja seletada).
Lõõmutustemperatuuri empiiriline väärtus on 60°C.Kui te pole kindel, kuidas valida sobivam lõõmutamistemperatuur?Vastus on sama, mis praimeri kontsentratsiooni valikul –gradiendi test.Probleemi illustreerimiseks tehke pilt ettevõttest Bio-rad.Teatud sihtfragmendi amplifitseerimiseks määrake kaheksa temperatuurigradienti, millest igaüks on kolme kordusega, ja saadud amplifikatsioonikõver on järgmine:

Lõõmutustemperatuuri valik:
·70°C, 69°C – põhimõtteliselt ei saa praimereid kombineerida, seega puudub võimendus.
·67,3°C – Alguses on väike võimendus ja Ct väärtus on suhteliselt suur.
·64,5°C——Ct väärtus väheneb.
· Temperatuuridel 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C ja 55,0 °C kippusid Ct väärtused olema põhimõtteliselt stabiilsed, kuid lõplikud fluorestsentsi väärtused olid erinevad.
Kuidas valida?Põhimõte: esimene põhimõte on kõrgem Ct väärtus.Sama Ct väärtuse jaoks valige kõrgem anniilimistemperatuur, et vältida dimeriseerumist ja mittespetsiifilist võimendust.Kuigi 55°C juures on fluorestsentsi väärtus kõrgem, võib selles esineda dimeere või mittespetsiifilist amplifikatsiooni.
Aga kui sa oled sama tark kui sina, siis kindlasti mõtled: Loogiliselt võttes, kui PCR reaktsioon on väga spetsiifiline, nii kaua, kuni praimeri kontsentratsioon ületab miinimumnõude, ei tohiks kõrged ja madalad punktid mõjuda, nagu fluorestseeruvad värvid ja dNTP-d.Tõepoolest, seni, kuni anniilimistemperatuur on õigesti optimeeritud, minimeeritakse loomulikult praimeri kontsentratsiooni mõju Ct väärtusele.

Lõõmutamistemperatuur on õigesti optimeeritud ja praimeri kontsentratsiooni mõju CT-le on minimaalne
Sekundaarne struktuur mõjutab võimenduse efektiivsust
Teeme probleemi illustreerimiseks pildi Bio-radist.Samuti kujundab see temperatuurigradiendi sekundaarse struktuuriga geeni võimendamiseks.

Tekib sekundaarne struktuur
On näha, et kui temperatuurigradient väheneb, hakkavad tekkima produktid ja Ct väärtus liigub edasi, saavutades minimaalse väärtuse 60,7°C juures ning seejärel temperatuurigradiendi vähenedes muutub Ct väärtus suuremaks.Ja vastupidi, temperatuuri tõustes avaneb sekundaarne struktuur ja võimenduse efektiivsus suureneb.Pärast teatud temperatuuri saavutamist ei saa temperatuuri tõstmine võimenduse efektiivsust parandada.Kuna praimereid ei saa praegu stabiilselt kombineerida.Seetõttuotsige madalaima Ct väärtusega temperatuuri, mis on parim temperatuur sekundaarstruktuuri malli võimendamiseks!Muidugi peavad nutikad lollid teadma, et kui see pole vajalik, on kõige parem praimereid vahetada ja vältida sekundaarstruktuuri piirkonda.
5. Rakenduse tase
MIQE – andmete analüüs

Andmete analüüs antakse peamiselt fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-seadmega.Eelmises artiklis on tehtud palju andmeanalüüsi töid, näiteks tühikontroll, mida on eksperimendi ülesehituses selgitatud.Selgitatud on sisemised referentsgeenid, kordusnumbrid jne., siin selgitame peamiselt qPCR-i rakendamist.
qPCR-i kasutatakse laialdaselt ning kõige sagedamini kasutatavad stsenaariumid on eksperimentaalne kontrollimine ja nukleiinhapete diagnostika.
absoluutne kvantifitseerimine
Log (esialgne kontsentratsioon) on lineaarselt seotud tsüklite arvuga.Teadaoleva esialgse koopiaarvuga standardist saab tõmmata standardkõvera, see tähendab, et saab saada amplifikatsioonireaktsiooni lineaarse seose.Proovi Ct väärtuse järgi saab arvutada kontsentratsiooni proovis.Kaasatavate mallide arv.

Absoluutne kvantitatiivne arvutamise meetod
Absoluutne kvantifitseerimine peab põhinema standardkõveral.Standardkõvera tegemiseks on vaja standardit.Tavaliselt on standardiks sihtgeeni kloonimise teel saadud plasmiid.Miks see on plasmiid?Kuna ringikujuline plasmiidne DNA on kõige stabiilsem.Lahjendage standardtoode 5-6 gradiendina vastavalt kahekordistussuhtele (10-kordne lahjendus) ja pöörake lahjendamisel tähelepanu ühtlusele.Laske Ct väärtusel langeda 15-30 vahele.

Standardne ettevalmistus
Samal ajal tuleks ka uuritavat proovi vastavalt lahjendada (pidage meeles lahjendustegurit), samuti peaks Ct väärtus jääma 15-30 vahele.Standardtoode + testitav proov pannakse masinale koos.Pärast jooksu tehti standardainega standardkõver ja kontsentratsiooni arvutamiseks viidi testitavad proovid standardkõverale.
B-hepatiidi viiruse HBV kvantifitseerimine on tüüpiline absoluutne kvantifitseerimine, mille abil saab arvutada viiruse koopiaarvu 1 ml veres.
Eksemplari numbri arvutamine
Testitava proovi kontsentratsioon (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × lahjendustegur
Proovi molekulmass = aluste arv × 324
Uuritava proovi koopiate arv (koopiaid/ul) = uuritava proovi kontsentratsioon / proovi molekulmass × 6 × 1014

Koopia numbri arvutamise meetod

Ülaltoodud on arvutusmeetod koguse määramiseks.See on matemaatiline ülesanne, mida saab lahendada pärast keskkooli lõpetamist ja matemaatilisi ülesandeid lahendavad üldiselt arvutid.Kui aru ei saa, võib tulla suhtlema.
suhteline kvantifitseerimine
Suhtelist kvantifitseerimist kasutatakse peamiselt teadusuuringutes.Kui palju viirusi on 1 ml veres ja see on DNA viirus, see on suhteliselt deterministlik sündmus: vere kogust saab määrata ja DNA viirus on suhteliselt stabiilne.Meil on aga raske võrrelda teatud geeni transkriptsioonikoopiate arvu lehes, kuna lehe suurust, kaalu ja õrnust on raske määrata, ekstraheeritud RNA kogust on raske määrata ning ka pöördtranskriptsiooni efektiivsust on raske määrata, st iga samm võib katseandmetes vigu tekitada ja neid ei saa kasutada.
Seetõttu peab suhteline kvantifitseerimine lisama elemendi:sisemine võrdlusgeen.
Teisisõnu, suhteline kvantifitseerimine on tegelikult sihtgeeni ja sisemise võrdlusgeeni võrdlus.Võrreldes samas koes ja samas rakus on proovi suuruse, RNA ekstraheerimise koguse, pöördtranskriptsiooni efektiivsuse ja PCR efektiivsuse mõju suhteliselt väike.Valimi väikese suuruse tõttu olid nii sisemised võrdlusgeenid kui ka sihtgeenid suhteliselt vähenenud.Seetõttu oleme varemgi rõhutanud ühtsust ja stabiilsust.
Sisemised võrdlusgeenid on üldiseltmajapidamisgeenid( house-keeping genes), mis viitavad geenide klassile, mis ekspresseeruvad stabiilselt kõigis rakkudes ja nende saadused on vajalikud rakkude põhilise elutegevuse säilitamiseks.
Ärge ajage seda mõistet segamini.Majapidamisgeenid on bioloogilise funktsiooni terminid, sisemised võrdlusgeenid aga eksperimentaalsed tehnilised terminid.Majapidamisgeenid peavad läbima valideerimise, enne kui neid saab valida sisemiste võrdlusgeenidena.
Näiteks valisime alloleval joonisel mitu majapidamisgeeni, et testida nende ekspressioonitaset erinevates koerakkudes ja leidsime, et β-2-mikroglobuliini ekspressioonitasemed olid üsna erinevad ülejäänud kolme geeni ekspressioonitasemetest, mistõttu neid ei saanud kasutada sisemiste võrdlusgeenidena.

Pärast sisemise võrdlusgeeni parandusfunktsiooni mõistmist tuletatakse kaks algoritmi sisemise võrdlusgeeni sisestamise tõttu.
·topeltstandardkõvera meetod
·2 – △△Ct meetod (CT väärtuste võrdlusmeetod)
Kui olete huvitatud liikide ja geenide funktsioonide uurimisest, siis palun loobuge algoritmide uurimisest ja kasutage valemeid otse või kasutage masinaid;kui olete matemaatikas ja inseneriteaduses sirgjooneline mees, siis võtke julgelt ühendust.
topeltstandardkõvera meetod
Kvantifitseerige kontrollproovi ja testitava proovi sihtgeen ja majapidamisgeen standardkõvera kaudu ning seejärel arvutage suhteline väärtus arvutusvalemi järgi, mis on suhteline ekspressioonitase.
Eelised: lihtne analüüs, suhteliselt lihtne eksperimentaalne optimeerimine
Puudus: iga geeni jaoks peab iga katsevoor moodustama standardkõvera
Kasutusala: üks kahest kõige sagedamini kasutatavast ja tunnustatud suhtelisest kvantitatiivsest meetodist geeniekspressiooni regulatsiooni uurimisel
Valem on järgmine:

Näited on järgmised.

Arvutage kvantitatiivse tulemuse põhjal suhteline summa
2 – △△Ct meetod (CT väärtuste võrdlusmeetod)

Eelised: pole vaja teha standardkõverat
Puudused: Eeldatakse, et võimenduse efektiivsus on 100% lähedal;standardhälve on < 5% ning eeldatakse, et standardkõver ja iga võimenduse vaheline efektiivsus on ühtsed;katsetingimuste optimeerimine on keerulisem.
Kasutusala: üks kahest kõige sagedamini kasutatavast ja tunnustatud suhtelisest kvantitatiivsest meetodist geeniekspressiooni regulatsiooni uurimisel

Muidugi on tavaliselt võimatu amplifikatsiooniefektiivsust olla täiuslikult 1. Korrektsioonimeetod: Kui teame, et sihtgeenil ja referentsgeenil on sama amplifikatsiooniefektiivsus, kuid amplifikatsiooniefektiivsus ei ole võrdne 1-ga, siis 2－△△Ct saab korrigeerida järgmiselt: (1+E )－△△, kui kasutegur võib olla korrigeeritud amplifikatsiooniks näiteks 0.9. 1,95–△△Ct
Siiani on fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-i sisu lõppenud.