Escherichia Coli O157: H7 nukleiinhappe tuvastamise komplekt (PCR fluorestsentssondi meetod/lüofiliseerimine)
Komplekti kirjeldus:
Kassi nr.FP103
Seda kasutatakse E. coli O157:H7 kiireks tuvastamiseks ja skriinimiseks toidu-, sööda-, vee- ja keskkonnaproovides.
Kirjeldused
Seda kasutatakse selleksE. coli O157:H7 kiire avastamine ja sõelumine toidu-, sööda-, vee- ja keskkonnaproovides.
[Testimise põhimõte]
Fluorestseeruva PCR-tehnoloogia põhimõtte kohaselt on Escherichia coli O157: H7 spetsiifilise geeni jaoks kavandatud spetsiifilised praimerid ja Taqmani sondid, mis tuvastatakse fluorestsents-PCR-seadmega, et võimaldada Escherichia coli O157: H7 tuvastamist DNA kvalitatiivne tuvastamine.
Komplekti sisu
Märkus: ROX-i kanalisond ei kuulu komplekti.
| Ckomponendid | Spetsifikatsioon | Qsuurus |
| Puhver A | Toru | 1 |
| Puhver B | Toru | 1 |
| Positiivne kontroll | Toru | 1 |
| Negatiivne kontroll | Toru | 1 |
Eeldatav kasutus
Seda kasutatakse selleks E. coli O157:H7 kiire avastamine ja sõelumine toidu-, sööda-, vee- ja keskkonnaproovides.
Säilitamistingimused ja aegumiskuupäev
Hoida temperatuuril -20 ℃ pimedas ja vältida korduvat külmutamist ja sulatamist.
Kehtivusaeg on 12kuud ja tootmiskuupäev on näidatud välispakendil.
Instrumendid ja tarbekaubad
Fluorestseeruv kvantitatiivne PCR instrument, pipetipüstol ja sobitusotsad, keerisloksuti, minitsentrifuug.
Kasutamine
1. Proovide töötlemine
1.1 Proovi tüüp: see komplekt sobib toidu-, sööda-, veeproovide ja muude proovide jaoks, mille puhul kahtlustatakse, et need on saastunud Escherichia coli O157:H7-ga.Sügavtöödeldud lihatoodete, jookide ja muude pigmente sisaldavate ainete puhul tuleb neid loputada, et vältida fluorestsentssignaali kogumist.
1.2 Proovi töötlemine: proovi ettevalmistamise, rikastuskultuuri ja Escherichia coli O157: H7 eraldamise kohta vaadake "GB 4789.10-2016 Toiduohutuse riiklik standard Toidu mikrobioloogiline uuring Escherichia coli O157: H7 test".
- Nukleiinhappe ekstraheerimine
Võtke 20 ml rikastuslahust 1,5 ml tsentrifuugiklaasi, lisage 200 μL mikroobset lüsaati (vaja on lisakomplekti), segage 30 sekundit keerisega, tsentrifuugige korraks ja pange kõrvale.
Märkused: Nukleiinhappe ekstraheerimine lüsaadist peaks lõppema 10 minuti jooksul ja seda ei saa pikka aega säilitada.
3. Nukleiinhapete võimendamine
3.1 Lülitage kasutamiseks sisse fluorestsents-kvantitatiivne PCR-seade.
Komplekti kuuluvad puhver A ja puhver B, sulatage need põhjalikult ja tsentrifuugige korraks.Lisage igasse PCR reaktsioonituubi 18 μL puhvrit A ja 2 μL puhvrit B.Seejärel lisage PCR reaktsiooni katseklaasidesse 5 ml negatiivset kontrolli, ekstraheeritud nukleiinhapet ja positiivset kontrolli, sulgege katseklaasid ja tsentrifuugige lühidalt.
3.3 Viige PCR reaktsioonitoru fluorestsents-PCR masinasse ja kasutage amplifikatsioonikatsete tegemiseks järgmisi protseduure: valige reaktsioonisüsteemi jaoks 25 ml, koguge iga tsükli jaoks fluorestsentssignaale temperatuuril 60 °C ja valige tuvastuskanaliks FAM.
| Samm | Programm | Tsüklite arv |
| 1 | 37℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 4 0 |
| 60 ℃ 30 s (koguda fluorestsentsi) |
Juhised probleemide analüüsimiseks
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
RNA-d ei saa ekstraheerida või nukleiinhappe saagis on madal
Taaskasutamise tõhusust mõjutavad tavaliselt paljud tegurid, näiteks: proovi RNA sisaldus, töömeetod, elueerimismaht jne.
Tavaliste põhjuste analüüs:
1.Jäävannis või madalal temperatuuril (4 °C) tsentrifuugimine töötamise ajal.
Soovitus: Toatemperatuuril (15-25 °C) töötamine, mitte kunagi jäävanni ja madala temperatuuriga tsentrifuugi kasutamine.
2. Proovide ebaõige säilitamine või liiga kauaaegne proovide säilitamine.
Soovitus: hoida proove temperatuuril -80 °C või külmutada vedelas lämmastikus ning vältida korduvat külmutamist-sulatamist;proovige RNA ekstraheerimiseks kasutada värskelt kogutud proove.
3. Ebapiisav proovi lüüs
Soovitus: veenduge, et proov ja töölahus (lineaarne akrüülamiid) on põhjalikult segatud ja inkubeeritud 10 minutit toatemperatuuril (15-25 °C).
4.Eluent lisati valesti
Soovitus: veenduge, et puhastuskolonni membraani keskele oleks lisatud RNaasivaba ddH2O
5. Vale kogus veevaba etanooli puhvris viRW2
Soovitus: järgige juhiseid, lisage puhvrile viRW2 õige kogus veevaba etanooli ja segage need enne komplekti kasutamist korralikult läbi.
6. Näidise vale kasutamine.
Soovitus: 200 µl proovi 500 µl puhvri viRL kohta.Liigne proovimaht vähendab RNA ekstraheerimise kiirust.
7.Vale elueerimismaht või mittetäielik elueerimine.
Soovitus: Puhastuskolonni eluendi maht on 30-50μl;kui elueerimisefekt ei ole rahuldav, on soovitatav lisada eelsoojendatud RNaasivaba ddH2O ja pikendage toatemperatuurile asetamise aega, näiteks 5-10 min
8. Puhastuskolonnis on pärast loputamist puhvris viRW2 etanooli jääk.
Soovitus: Kui pärast loputamist puhvris viRW2 ja tsentrifuugimist tühjas katsutis 2 minuti jooksul jääb etanooli alles, võib puhastuskolonni pärast tühjas katseklaasis tsentrifuugimist jätta toatemperatuurile 5 minutiks, et eemaldada täielikult järelejäänud etanool.
Puhastatud RNA molekulide lagunemine
Puhastatud RNA kvaliteet on seotud selliste teguritega nagu proovide säilitamine, RNaasi saastumine ja toimimine.
Tavaliste põhjuste analüüs:
1.Kogutud proove ei salvestatud õigeaegselt.
Soovitus: kui proovi ei kasutata õigeaegselt pärast kogumist, hoidke seda kohe temperatuuril -80 ℃ või vedelas lämmastikus.RNA molekulide ekstraheerimiseks proovige võimalusel kasutada värskelt kogutud proove.
2. Kogutud proove külmutati ja sulatati korduvalt.
Soovitus: Vältige korduvat külmutamist ja sulatamist (mitte rohkem kui üks kord) proovi kogumise ja säilitamise ajal, vastasel juhul väheneb nukleiinhappe saagis.
3. Operatsioonisaalis võeti kasutusele RNaasi või ei kantud ühekordseid kindaid, maske jms.
Soovitus: RNA molekulide ekstraheerimise katset on kõige parem teha eraldi RNA operatsiooniruumis ja katselaud puhastatakse enne katset.Katse ajal kandke ühekordselt kasutatavaid kindaid ja maske, et vältida RNaasi sissetoomisest põhjustatud RNA lagunemist.
4. Reaktiiv on kasutamise ajal saastunud RNaasiga.
Soovitus: Asendage seotud katsete jaoks uue viiruse RNA isolatsioonikomplektiga.
5. Tsentrifuugitorude, pipetiotsikute jne RNaasi saastumine. Soovitus: Veenduge, et tsentrifuugitorud, pipetiotsad ja pipetid on kõik RNaasivabad.
Puhastatud RNA molekulid mõjutasid allavoolu katseid
Puhastuskolonnis puhastatud RNA molekulid mõjutavad allavoolu katseid, kui soolaioone või valke on liiga palju, näiteks: pöördtranskriptsioon, Northern Blot jne.
1.Elueeritud RNA molekulides on allesjäänud soolaioone.
Soovitus: Veenduge, et puhvrile viRW2 on lisatud õige kogus veevaba etanooli, ja peske puhastuskolonni kaks korda vastavalt kasutusjuhendis toodud õigele tsentrifuugimiskiirusele. Kui soolaioone on veel alles, võite puhastuskolonnile lisada puhvrit viRW2 ja jätta selle 5 minutiks toatemperatuurile.Seejärel teostage tsentrifuugimine, et eemaldada soolaioonidega saastumine suurimal määral
2.Elueeritud RNA molekulides on järelejäänud etanooli
Soovitus: kui olete veendunud, et puhastuskolonnid on puhvriga viRW2 loputatud, viige läbi tühja toru tsentrifuugimine vastavalt kasutusjuhendis toodud tsentrifugaalkiirusele.Kui etanooli on veel alles, võib selle pärast tühjas katseklaasis tsentrifuugimist jätta toatemperatuurile 5 minutiks, et eemaldada kõige rohkem järelejäänud etanooli.
Kasutusjuhendid:
Viiruse RNA isolatsioonikomplekti kasutusjuhend
