Ei mingeid võimendussignaale

1. Komplektis olev Taq DNA polümeraas kaotab oma aktiivsuse komplekti ebaõige ladustamise või aegumise tõttu.
Soovitus: Kontrollige komplekti säilitustingimusi;lisage PCR-süsteemi uuesti sobiv kogus Taq DNA polümeraasi või ostke seotud katsete jaoks uus reaalajas PCR-komplekt.

2. DNA matriitsis on palju Taq DNA polümeraasi inhibiitoreid.
Soovitus: puhastage mall uuesti või vähendage kasutatava malli kogust.

3. Mg2+ kontsentratsioon ei sobi.
Soovitus: meie pakutava 2× Real PCR segu Mg2+ kontsentratsioon on 3,5 mM.Mõnede spetsiaalsete praimerite ja mallide puhul võib Mg2+ kontsentratsioon siiski olla suurem.Seetõttu saate Mg2+ kontsentratsiooni optimeerimiseks MgCl2 otse lisada.Optimeerimiseks on soovitatav iga kord Mg2+ 0,5 mM suurendada.

4. PCR amplifikatsiooni tingimused ei ole sobivad ja praimeri järjestus või kontsentratsioon on vale.
Soovitus: kinnitage praimeri järjestuse õigsust ja praimer ei ole lagunenud;kui võimendussignaal ei ole hea, proovige lõõmutamistemperatuuri alandada ja praimeri kontsentratsiooni sobivalt reguleerida.

5. Malli kogus on liiga vähe või liiga palju.
Soovitus: viige läbi matriitsi lineariseerimise gradiendi lahjendus ja valige reaalajas PCR-eksperimendi jaoks parima PCR-efektiga matriitsi kontsentratsioon.

NTC-l on liiga kõrge fluorestsentsi väärtus

1. Töö käigus tekkinud reaktiivi saastumine.
Soovitus: asendage reaalajas PCR-katsete jaoks uute reaktiividega.

2. Saastumine toimus PCR reaktsioonisüsteemi ettevalmistamise ajal.
Soovitus: Kasutage töö ajal vajalikke kaitsemeetmeid, näiteks: kandke latekskindaid, kasutage filtriga pipetiotsikut jne.

3. Praimerid lagunevad ja praimerite lagunemine põhjustab mittespetsiifilist amplifikatsiooni.
Soovitus: kasutage SDS-PAGE elektroforeesi, et tuvastada, kas praimerid on lagunenud, ja asendage need reaalajas PCR-katsete jaoks uute praimeritega.

Praimeri dimeer või mittespetsiifiline amplifikatsioon

1. Mg2+ kontsentratsioon ei sobi.
Soovitus: meie pakutava 2× Real PCR EasyTM Mixi Mg2+ kontsentratsioon on 3,5 mM.Mõnede spetsiaalsete praimerite ja mallide puhul võib Mg2+ kontsentratsioon siiski olla suurem.Seetõttu saate Mg2+ kontsentratsiooni optimeerimiseks MgCl2 otse lisada.Optimeerimiseks on soovitatav iga kord Mg2+ 0,5 mM suurendada.

2. PCR anniilimistemperatuur on liiga madal.
Soovitus: tõstke PCR anniilimistemperatuuri iga kord 1 ℃ või 2 ℃ võrra.

3. PCR toode on liiga pikk.
Soovitus: reaalajas PCR toote pikkus peaks olema vahemikus 100-150 bp, mitte üle 500 bp.

4. Praimerid lagunevad ja praimerite lagunemine toob kaasa spetsiifilise amplifikatsiooni ilmnemise.
Soovitus: kasutage SDS-PAGE elektroforeesi, et tuvastada, kas praimerid on lagunenud, ja asendage need reaalajas PCR-katsete jaoks uute praimeritega.

5. PCR-süsteem on vale või süsteem on liiga väike.
Soovitus: PCR-reaktsioonisüsteem on liiga väike, mistõttu tuvastamise täpsus väheneb.Reaalaja PCR-eksperimendi taaskäivitamiseks on kõige parem kasutada kvantitatiivse PCR-instrumendi soovitatud reaktsioonisüsteemi.

Kvantitatiivsete väärtuste halb korratavus

1. Seade töötab valesti.
Soovitus: Instrumendi iga PCR-ava vahel võib esineda vigu, mille tulemuseks on halb reprodutseeritavus temperatuuri juhtimise või tuvastamise ajal.Kontrollige vastavalt vastava instrumendi juhistele.

2. Proovi puhtus ei ole hea.
Soovitus: ebapuhtad proovid põhjustavad katse halva reprodutseeritavuse, mis hõlmab malli ja praimerite puhtust.Parim on malli uuesti puhastada ja praimereid saab kõige paremini puhastada SDS-PAGE abil.

3. PCR-süsteemi ettevalmistamise ja säilitamise aeg on liiga pikk.
Soovitus: kasutage reaalajas PCR-süsteemi PCR-eksperimendiks kohe pärast valmistamist ja ärge jätke seda liiga kauaks kõrvale.

4. PCR amplifikatsiooni tingimused ei ole sobivad ja praimeri järjestus või kontsentratsioon on vale.
Soovitus: kinnitage praimeri järjestuse õigsust ja praimer ei ole lagunenud;kui võimendussignaal ei ole hea, proovige lõõmutamistemperatuuri alandada ja praimeri kontsentratsiooni sobivalt reguleerida.

5. PCR-süsteem on vale või süsteem on liiga väike.
Soovitus: PCR-reaktsioonisüsteem on liiga väike, mistõttu tuvastamise täpsus väheneb.Reaalaja PCR-eksperimendi taaskäivitamiseks on kõige parem kasutada kvantitatiivse PCR-instrumendi soovitatud reaktsioonisüsteemi.