Oleme olnud kogenud tootja.Suurema allahindlusega Hiina kõrge tundlikkusega üheastmelise sondi Rt-le enamuse oma turu olulistest sertifikaatidest võitmine.QpcrKomplekt V2, kvaliteet on tehase elu, keskendumine klientide nõudlusele on ettevõtte ellujäämise ja arengu allikas, järgime ausust ja heas usus töötavat suhtumist, ootame teie tulekut!
Oleme olnud kogenud tootja.Võitnud enamuse oma turu olulistest sertifikaatidestHiina Taq DNA polümeraas, Qpcr, Meie ettevõte lubab: mõistlikud hinnad, lühike tootmisaeg ja rahuldav müügijärgne teenindus, samuti tervitame teid külastama meie tehast igal ajal, kui soovite.Soovin, et meil oleks nüüd meeldiv ja pikaajaline ühine äri!!!

Kirjeldused

See komplekt kasutab ainulaadset lüüsipuhvri süsteemi, mis suudab kiiresti vabastada RNA kultiveeritud rakuproovidest RT-qPCR reaktsioonide jaoks, välistades sellega aeganõudva ja töömahuka RNA puhastamise protsessi.RNA matriitsi saab kätte vaid 7 minutiga.Komplektis olevad 5×Direct RT Mix ja 2×Direct qPCR Mix-SYBR reaktiivid võivad kiiresti ja tõhusalt saada reaalajas kvantitatiivseid PCR-tulemusi.

5×Direct RT Mixil ja 2×Direct qPCR Mix-SYBR-il on tugev inhibiitoritaluvus ning proovide lüsaati saab kasutada otse RT-qPCR mallina.See komplekt sisaldab ainulaadset RNA kõrge afiinsusega Foregene pöördtranskriptaasi ja Hot D-Taq DNA polümeraasi, dNTP-sid, MgCl₂, reaktsioonipuhver, PCR optimeerija ja stabilisaator.

Tehnilised andmed

200 × 20 μl Rxns, 1000 × 20 μl Rxns

Komplekti komponendid

Omadused ja eelised

■ Lihtne ja tõhus: Cell Direct RT tehnoloogiaga saab RNA proove võtta vaid 7 minutiga.

■ Valimivajadus on väike, testida saab kuni 10 rakku.

■ Suur läbilaskevõime: suudab kiiresti tuvastada RNA rakkudes, mida on kultiveeritud 384, 96, 24, 12, 6 süvendiga plaatidel.

■ DNA Eraser suudab vabanenud genoome kiiresti eemaldada, mis vähendab oluliselt mõju järgnevatele katsetulemustele.

■ Optimeeritud RT- ja qPCR-süsteem muudab kaheetapilise RT-PCR-i pöördtranskriptsiooni tõhusamaks ja PCR-i spetsiifilisemaks ning RT-qPCR-i reaktsiooni inhibiitoritele vastupidavamaks.

Komplekti rakendus

Kasutusala: kultiveeritud rakud.

- Proovi lüüsil vabanev RNA: kehtib ainult selle komplekti RT-qPCR matriitsi puhul.

- Komplekti saab kasutada järgmistel eesmärkidel: geeniekspressiooni analüüs, siRNA-vahendatud geeni vaigistava toime kontrollimine, ravimite sõelumine jne.

Diagramm

Ladustamine ja säilivusaeg

Selle komplekti I osa tuleks hoida temperatuuril 4 ℃;II osa tuleks hoida temperatuuril -20 ℃.

Foregene Protease Plus II tuleks hoida temperatuuril 4 ℃, mitte külmutada temperatuuril -20 ℃.

Reaktiivi 2×Direct qPCR Mix-SYBR tuleks hoida temperatuuril -20 ℃ pimedas;kui seda kasutatakse sageli, võib seda säilitada ka temperatuuril 4 ℃ lühiajaliseks säilitamiseks (kasutatakse ära 10 päeva jooksul). Oleme kogenud tootja.Suurema allahindlusega Hiina suure tundlikkusega üheastmelise sondi Rt-Qpcr komplekt V2 võitnud enamuse oma turu olulistest sertifikaatidest, kvaliteet on tehase elu, keskendumine klientide nõudlusele on ettevõtte ellujäämise ja arengu allikas, järgime ausust ja heauskse töösuhtumist, ootame teie tulekut!
Suur allahindlusHiina Taq DNA polümeraas, Qpcr, Meie ettevõte lubab: mõistlikud hinnad, lühike tootmisaeg ja rahuldav müügijärgne teenindus, samuti tervitame teid külastama meie tehast igal ajal, kui soovite.Soovin, et meil oleks nüüd meeldiv ja pikaajaline ühine äri!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.nr.DRT-01021/01022

Raku otsese RT-qPCR jaoks, kasutades ≤ 1000 000 rakku

Toote tutvustus

See toode kasutab ainulaadset lüüsipuhvri süsteemi, et kiiresti vabastada RNA kultiveeritud rakuproovidest RT-qPCR reaktsioonide jaoks, välistades aeganõudva ja töömahuka RNA puhastusprotsessi ning vajaliku RNA matriitsi saamiseks kulub vaid 7 minutit. Komplekti 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman annab reaalajas tõhusad tulemused kiirelt ja kiiresti.

5× Direct RT Mix ja 2× Direct qPCR Mix-Taqman omavad tugevat inhibiitoritaluvust ning suudavad tõhusalt ümber pöörata ja spetsiifilist amplifikatsiooni kasutades mallina mõõdetava proovi lüsaati.Reaktiiv sisaldab Foregene pöördtranskriptaasi, Hot D-Taq DNA polümeraasi, dNTP-sid, MgCl₂, reaktsioonipuhver, PCR optimeerija ja stabilisaator, mida saab kasutada koos lüüsipuhvriga proovide kiireks ja hõlpsaks tuvastamiseks ning millel on kõrge tundlikkus, spetsiifilisus ja stabiilsus.

Toote omadused

Lihtne ja tõhus Cell Direct RT tehnoloogia, mis võtab RNA proovide saamiseks vaid 7 minutit.

Proovide nõuded on väikesed ja katsetamiseks saab kasutada vähemalt 10 kultiveeritud rakku.

Suur läbilaskevõime kultiveeritud rakkude, näiteks 384, 96, 24, 12 ja 6 süvendiga plaatide kiireks RNA omandamiseks.

DNA Eraser suudab vabanenud genoome kiiresti eemaldada, vähendades oluliselt mõju järgnevatele katsetulemustele.

Optimeeritud RT- ja qPCR-süsteemid võimaldavad kaheastmelist RT-PCR-i, millel on tõhusam pöördtranskriptsioon, spetsiifilisus ja tugevam RT-qPCR reaktsiooni inhibiitori taluvus.

Komplekti rakendus

Kasutusala: kultiveeritud rakud.

Proovi lüüsi tõlgendatud RNA: kasutatakse ainult kaheastmelise RT-qPCR matriitsina.

Komplekte saab kasutada järgmistel eesmärkidel: geeniregulatsiooni ekspressioonianalüüs, alleelide testimine, ravimite sõeluuring jne.

Komplekti piirangud

Amplifitseeritud fragmendid ≤ 300 bp.

Rakkude värskeks kasvatamiseks kasutatakse komplekte.

Toote kvaliteedi kontroll

Vastavalt FOREGENE täielikule kvaliteedijuhtimissüsteemile testitakse iga Cell Direct RT-qPCR seeria komplektide partiid mitu korda rangelt, et tagada iga komplektipartii kvaliteedi usaldusväärsus ja stabiilsus.

Komplekti sisu

*:Cell Lysis, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqmani saab osta eraldi, üksikasjad on toodud lisas 1 (LK 13).

Säilitamistingimused

1. Tarnetingimused

Kogu madala temperatuuriga jääpakendi kasti transportimise protsess, et tagada komplekti olek <4 °C.

2. Säilitustingimused

Hoida I osa temperatuuril 4°C ja II osa temperatuuril -20°C.

Foregene Protease Plus II tuleb hoida temperatuuril 4 °C, mitte külmutada temperatuuril -20 °C.

Reaktiivi 2× Direct qPCR Mix-Taqmani hoitakse temperatuuril -20°C või lühiajaliseks kasutamiseks temperatuuril 4°C, kui seda kasutatakse sageli (10 päeva jooksul).

Komplekti komponentide teave

Puhver CL: pakub rakkude lüüsireaktsioonideks vajalikku keskkonda.

Puhver ST: lõpetab toimeaine lüsaadis, et vältida mõju järgnevale RT-le.

DNA Eraser: DNA eemaldaja, genoomi eemaldamise mõju järgmistele katsetele.

5× Direct RT Mix: sisaldab kõrge RNA afiinsusega Foregene pöördtranskriptaasi, RNaasi inhibiitorit, dNTP-sid, stabilisaatoreid, võimendajaid, optimeerijaid ja pöördtranskriptsiooni praimereid optimaalseks joondamiseks (juhuslik praimer, oligo(dT)₁₈Praimer).

Foregene Protease Plus II: Lüüsipuhvri kontekstis rakud lüüsitakse nukleiinhapete vabastamiseks.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: see reagent sisaldab kuuma D-Taq DNA polümeraasi, dNTP-sid, MgCl₂, reaktsioonipuhver, PCR optimeerija ja stabilisaator.

20 × ROX-i võrdlusvärv: tavaliselt kasutatakse ABI, Stratagene ja teiste ettevõtete reaalajas PCR-võimendusinstrumentidel, seda kasutatakse PCR-torude ja PCR-i doseerimisvigadest põhjustatud tuubide erinevuse reguleerimiseks.Erinevate instrumentide jaoks vajalik 20× ROX Reference Dye kontsentratsioon on erinev ja kasutaja saab seda lisada vastavalt instrumendi soovitatud kontsentratsioonile.

RNaasivaba ddH₂O: RNaasivaba steriliseeritud ülipuhas vesi kaheetapiliste RT-qPCR reaktsioonide jaoks.

Ettevaatusabinõud:(Enne komplekti kasutamist lugege hoolikalt ettevaatusabinõusid)

Proovidevahelise ristsaastumise vältimiseks pöörake tähelepanu katse töömeetodile.

Pöörake tähelepanu katsekeskkonna ja nõude puhtusele, et vältida RNaasi saastumist ja RNA lagunemist.

Võtke värsked või hästi säilinud rakuproovid ja ärge kunagi kasutage korduvaid külmutatud-sulatatud rakuproove.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman peaks vältima korduvat külmutamist-sulatamist, vastasel juhul mõjutab see pöördtranskriptsiooni ja PCR tõhusust.

Ettevalmistusratsioonidenneoperatsiooni

Enne selle komplekti kasutamist lugege kindlasti juhiseid hoolikalt läbi.Cell Direct RT-qPCR komplekt on lihtne, mugav ja kiire kasutada ning juhised annavad täielikku teavet kogu komplekti ja selle õige kasutamise kohta.Enne kasutamist valmistage ette vajalikud katsematerjalid ja seadmed.

Katsematerjalid ja seadmed

◆ Rakkude kultiveerimine.

◆ 1,5 ml või 2 ml, RNaasi-/DNaasivaba tsentrifuugituub, RNaasi-/DNaasivaba ots, 0,2 ml steriilne qPCR katsut.

◆ qPCR masin, pipett, lauatsentrifuug (≥13 400×g) (olenevalt katsevajadustest) jne.

Ohutus

◆ See toode on mõeldud ainult teaduslikuks uurimistööks, palun ärge kasutage seda farmaatsia-, kliinilistel, toidu- ega kosmeetilistel eesmärkidel.

◆ Kemikaalide kasutamisel kandke sobivaid laborirõivaid, kindaid, kaitseprille jne.

Operatsioonjuhendid

Rakkude lüüsisüsteeme, RT-süsteeme ja qPCR-i reaktsioonilahuse lisapakke saab osta eraldi, üksikasjad leiate 1. lisast (LK 13).

Kasutusjuhend

V: RNA proovi vabastamine

1. Rakke töödeldi eelnevalt: peske rakukultuuri plaati külma PBS-ga, seejärel lüüsige rakud (10-10⁶), 10⁶ kui rakkude kogus, on RNA ekstraheerimiseks ja puhastamiseks soovitatav Foregene the Cell an RNA Isolation Kit Total (DE-03111) või Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011).

1.1.Kleepuvad rakud (näide on 24-auguline plaat)

1.1.1.Määrake rakkude arv igas süvendis, määrake, et rakkude arv on 1 × 10⁵ja kasutage kultiveerimisnõust söötme eemaldamiseks pipetti.

1.1.2.Lisage igasse süvendisse 200 μl eeljahutatud 1 × PBS-i.Ärge pipeteerige korduvalt ja eemaldage süvenditest PBS.Kallutage plaati ja eemaldage nii palju PBS-i kui võimalik.Jätkake 2. sammuga.

1.1.3.Erinevat rakukultuuri tassi või viitenumbrite tabelit 1-1 rakukultuuri tassis lisati rakkude pesemiseks eeljahutatud 1 × PBS.

Tabel 1-1: PBS-i annus erineva arvu rakkude jaoks

Märge:Kindlate rakkude kleepumise tagamiseks，pesemisel välditakse suurt hulka rakkude kadu.

1.2.Mittepoorsetel plaatidel kultiveeritud suspensioonrakud või kleepuvad rakud

1.2.1.Kleepunud rakud, mida kasvatatakse mitte-mitme süvendiga plaatidel (suspensioonrakud algavad järgmisest etapist 1.2.2), kogutakse ja eraldatakse rakud tavapärase rakkude kogumise meetodi kohaselt ning asetatakse kultiveerimisplaadile või tsentrifuugituubi;kui kasutatakse trüpsiniseerimist, nõuda rakkude kogumiseks ja jääktrüpsiini eemaldamiseks tsentrifuugimist, rakkude dispergeerimiseks lisati üksikutesse rakkudesse PBS-ga resuspendeeritud rakud.

1.2.2.Pärast loendatud rakkude arvu jagati rakud alikvootidega 1 × 10⁵ üks tsentrifuugimiseks, koguge rakud tsentrifuugimisega 1000 × g juures 10 minutit.

1.2.3.Lisage tsentrifuugituubi 200 μl PBS-i, ärge pipeteerige korduvalt ja aspireerige PBS otse.jätkake etapiga 2. (Kui sadestamine on raske ja rakud resuspendeeriti uuesti, võib teha 1000 × g tsentrifuugimist 10 minutit pärast supernatandi äraviskamist, rakusade jätkab sammuga 2)

2. Rakkude lüüs: eemaldage puhver CL, mille temperatuur on tasakaalustatud toatemperatuurile, DNA Eraser ja Foregene Protease Plus II, vastavalt järgmisele tabelile 1-2, valmistatud lüüsisüsteem: (Lüüsilahus on kasutamiseks valmis).

Tabel 1-2: lõhustumine süsteemi ettevalmistamine (Märkus: jääl ettevalmistamisel)

3. (24 süvendiga plaat näitena) Pipeteerige igasse süvendisse 200 μl rakkude lüüsi põhisegu, puhuge korduvalt 5-10 korda, inkubeerige toatemperatuuril (20-25 ℃) 5 minutit.

Märge:Mullide moodustumise vältimiseks reguleerige pipeti skaala 200 μl või alla selle.Rakud võivad pärast lüüsimist tunduda hägused, mis on normaalne.

4. (näitena 24 süvendiga plaat) lisatakse vedelasse 20 μl puhvrit ST (erinevad lüüsisüsteemid Puhvrit ST lisati tabelis 1-3 näidatud koguses), korduvalt pipeteerides 5-10 korda, toatemperatuuril (20-25 ℃) inkubeeriti 2 minutit.

Märge:Pipeti ots paiknes pinna all, tagades lüsaadi lisamise，mullide moodustumise vältimiseks reguleerige pipeti skaala 200 μl või vähema.

Tabel 1-3:Lisa puhver ST

5. Lüsaati kasutatakse järgmistes RT-qPCR katsetes.Kui järgnevaid katseid ei saa õigeaegselt läbi viia, hoidke seda jääl mitte rohkem kui 2 tundi ja hoidke temperatuuril -20 ℃ või -80 ℃ (mitte rohkem kui kolm kuud).

B: RT-süsteemi ettevalmistamine

1. Võtke välja 5 × Direct RT Mix ja asetage see jäävannile, laske sellel loomulikult sulada ja segage õrnalt hilisemaks kasutamiseks;Võtke RNaasivaba ddH2O välja ja sulatage see ning asetage hilisemaks kasutamiseks jäävannile.Valmistage reaktsioonisüsteem ette jääl vastavalt allolevale tabelile 2-1.

Tabel 2-1: RT reaktsioonisüsteemi valmistamine

2.Pärast süsteemi formuleerimise lõpetamist segage õrnalt ja tsentrifuugige lühidalt järgmises tabelis 2 -2 reaktsioonitingimused RT reaktsioon.

Tabel 2-2: RT Reaktsioonitingimuste seadistus

3.Pärast reaktsiooni lõppemist asetati reaktsioonisaadus qPCR jaoks otse jääle, pange pikaajaline säilitus -20 ℃ või -80 ℃.

Märkus. Puhastamata matriitsi kasutamise tõttu võivad pöördtranskriptsiooniproduktis ilmneda valged sademed.See on normaalne nähtus.Tsentrifuugige supernatant kohe järgmisteks katseteks.

Saadud RT reaktsioonilahus lisatakse järgmise etapi reaalajas PCR reaktsioonisüsteemidesse, soovitatav on lisada kogused, mis jäävad vahemikku 10-30% reaktsioonisüsteemist.

C: qPCR reaktsioonisüsteemi valmistamine

1. Sobiv kogus B-d, mis valmistati etapis cDNA matriitsis vastavalt järgmisele tabelile 3-1, et valmistada reaktsioonisüsteem.

Märkus. cDNA malli kogus moodustab qPCR süsteemist 10–30%.Näiteks 20 μl qPCR süsteemis lisage 2–6 μl lüüsipuhvrit, kuid mitte rohkem kui 6 μl.

2. Heade qPCR tingimuste optimeerimine (anniilimistemperatuur jne) qPCR reaktsiooni jaoks (reaktsioonitingimused on toodud tabelis 3-2).

Märkus. Paremate tulemuste saamiseks proovige kasutada qPCR reaktsioonide jaoks optimeeritud tingimusi.

Tabel 3-1: PCR reaktsioonisüsteemi valmistamine

1*: praimeri kontsentratsiooni saab reguleerida vahemikus 50-900 nM, kui praimeri reaktsioon on halb.

Märkus. qPCR-süsteemi saab kohandada vastavalt eksperimentaalsetele vajadustele ja fluorestsentsitsükli mudelile.qPCR jaoks 50-sμl süsteemi, reguleerige reaktiivi annust proportsionaalselt vastavalt 20μl süsteem.

2*: valige ROX-i võrdlusvärvi sobiv lõppkontsentratsioon vastavalt fluorestsentsi kvantitatiivsele termotsüklerile.Kõige sobivamad ROX-i võrdlusvärvi kontsentratsioonid tavaliste fluorestsentsi kvantitatiivsete tsüklerite jaoks on näidatud allolevas tabelis.

Tabel 3-2: esitatud on qPCR reaktsiooni tingimused

Märkus. Parima qPCR efekti saavutamiseks võib erinevate mallide ja erinevate praimerite reaktsioonitingimuste optimeerimiseks kasutada gradient-PCR-i.PCR-reaktsiooni tingimused varieeruvad sõltuvalt fluorestsentsanalüsaatorist, matriitsist, praimerist jne. Konkreetse toimingu puhul tuleb optimaalsed reaktsioonitingimused kujundada vastavalt fluorestsentsi kvantitatiivse termilise tsükleri spetsiifilistele tingimustele, matriitsi tüübile, huvipakkuva fragmendi suurusele, amplifitseeritud fragmendi alusjärjestusele ja GC sisaldusele ning praimerite pikkusele, sealhulgas anniilimistemperatuurile jne.

Reaalajas PCR praimeri kujundamise põhimõtted

Forward Primer ja Reverse Primer

Real Time PCR jaoks on praimeri disain väga oluline.Praimerid on seotud PCR amplifikatsiooni spetsiifilisuse ja efektiivsusega ning neid saab kujundada järgmiste põhimõtete alusel:

◆ Praimeri pikkus: 18-30 bp.

◆ GC sisaldus: 40-60%.

◆ Tm väärtus: praimeri projekteerimise tarkvara, näiteks Primer 5, võib anda praimeri Tm väärtuse.Üles- ja allavoolu praimerite Tm väärtused peaksid olema võimalikult lähedased.Kasutada võib ka Tm arvutamise valemit: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).PCR-i läbiviimisel valitakse tavaliselt anniilimistemperatuuriks temperatuur, mis on madalam kui praimeri Tm väärtus 5 °C (vastav anniilimistemperatuuri tõus võib suurendada PCR-reaktsiooni spetsiifilisust).

◆ Praimerid ja PCR-tooted:

◆ Disainpraimeri PCR amplifikatsiooniprodukti pikkus on eelistatavalt 100-150 bp.

◆ Kujunduskruntide kasutamist malli teiseses struktuuripiirkonnas tuleks võimalikult palju vältida.

◆ Vältige 2 või enama komplementaarse aluse moodustumist ülesvoolu ja allavoolu praimerite 3'-otste vahel.

◆ Krundi 3′ klemmipõhja ei saa olla koos 3 täiendava järjestikuse G või C-ga.

◆ Praimeritel endil ei saa olla komplementaarseid struktuure, vastasel juhul moodustub juuksenõelastruktuur, mis mõjutab PCR amplifikatsiooni.

◆ ATCG peaks jaotuma praimeri järjestuses võimalikult ühtlaselt ja 3′-terminaalset alust tuleks vältida kui T.

Lisa1:Cell OtseneRT-qPCR Komplekti komponentt lisapakk

1. Rakkude lüüsi lahus