Pipetiotste ja EP torude steriliseerimine jne.

1. Valmistage 0,1% (üks tuhandik) DEPC (väga toksiline aine) deioniseeritud veega, kasutage seda ettevaatlikult tõmbekapis ja hoidke seda valguse eest kaitstult temperatuuril 4 °C;

DEPC vesi on puhas vesi, mida on töödeldud DEPC-ga ning steriliseeritud kõrgel temperatuuril ja kõrgel rõhul.Testitud RNaasi-, DNaasi- ja proteinaasivabaks.

2. Pange pipeti ots ja EP toru 0,1% DEPC-sse ja veenduge, et pipetiots ja EP toru on täidetud 0,1% DEP-ga.

3. Kaitske valguse eest, laske seista üleöö (12-24h)

4. Otsa ja EP toru sisaldavat kasti ei pea DEPC-s leotama.Pärast DEPC vee jämedat eemaldamist otsast või EP torust pakkige see kokku ja mähkige kokku.

5. 121 kraadi Celsiuse järgi, 30 min

6. 180 kraadi Celsiuse järgi, kuivatada mitu tundi (vähemalt 3 tundi)

Märkus: a.DEPC käsitsemisel kandke latekskindaid ja maske!b või ilma DEPC steriliseerimiseta, 130 ℃, 90 min autoklaav (paljudes laborites steriliseeritakse kõrgel temperatuuril kaks korda)

RNA ekstraheerimise kaalutlused

Kaks peamist koe RNA isoleerimise ebaõnnestumise nähtust

RNA lagunemine ja lisandite jäägid kudedes,Mis puudutab lagunemist, siis vaatame kõigepealt, miks kultiveeritud rakkudest eraldatud RNA ei lagune kergesti.Kõik olemasolevad RNA ekstraheerimisreagendid sisaldavad komponente, mis inhibeerivad kiiresti RNaasi.Lisage lüsaat kultiveeritud rakkudele ja lihtsalt segage, kõik rakud saab lüsaadiga põhjalikult segada ja rakud on täielikult lüüsitud.Pärast rakkude lüüsimist inhibeerivad lüsaadis olevad toimeained koheselt rakusisest RNaasi, nii et RNA jääb puutumatuks.See tähendab, et kuna kultiveeritud rakud on lüsaadiga kergesti ja täielikult kontaktis, ei lagune nende RNA kergesti;teisest küljest laguneb koes olev RNA kergesti, kuna koe rakkudel ei ole kerge lüsaadiga kiiresti kontakti saada.piisava kontakti tõttu.Niisiis,eeldades, et RNA aktiivsust inhibeerides saab kude muuta üheks rakuks, võib lagunemise probleemi täielikult lahendada.

Vedela lämmastikuga jahvatamine on kõige tõhusam selline meetod.Vedela lämmastiku jahvatamise meetod on aga väga tülikas, eriti kui proovide arv on suur.Sellest sündis paremuselt järgmine asi: homogenisaator.ThehomogenisaatorMeetod ei võta arvesse küsimust, kuidas RNaasi aktiivsust inhibeeritakse enne, kui rakud lüsaadiga kokku puutuvad, vaid pigem palvetatakse, et koe katkemise kiirus oleks kiirem kui kiirus, millega rakusisene RNaasi lagundab RN-i.

Elektrilise homogenisaatori mõju on parem,ja klaasi homogenisaatori mõju on halb, kuid üldiselt ei saa homogenisaatori meetod lagunemisnähtust ära hoida.Seega, kui ekstraheerimine on halvenenud, tuleks vedela lämmastikuga jahvatamiseks kasutada algset elektrilist homogenisaatorit;algne klaashomogenisaator tuleks vahetada elektrihomogenisaatori vastu või jahvatada otse vedela lämmastikuga.Probleem on peaaegu 100% teostatav.lahenema.

Lisandite jääkide probleemil, mis mõjutab järgnevaid katseid, on rohkem erinevaid põhjuseid kui lagunemisel ja lahendused on vastavalt erinevad.Kokkuvõtteks,kui koes esineb lagunemist või jääklisandid, tuleb konkreetse katsematerjali ekstraheerimismeetod/reagent optimeerida.Sa ei pea kasutama optimeerimiseks oma hinnalisi proove: võid osta turult väikseid loomi, näiteks kala/kana, võtta vastava osa materjalist RNA ekstraheerimiseks ja teise osa valgu ekstraheerimiseks – jahvatada suu, mao ja soolte ekstraktiga.

Ekstraheeritud RNA siht-RNA-d kasutatakse erinevateks järelkatseteks ja selle kvaliteedinõuded on erinevad

cDNA raamatukogu konstrueerimine nõuab RNA terviklikkust ilma ensüümreaktsiooni inhibiitorite jääkideta;Northern nõuab kõrgemat RNA terviklikkust ja madalamaid nõudeid ensüümreaktsiooni inhibiitorite jääkidele;RT-PCR ei nõua liiga kõrget RNA terviklikkust,kuid pärsib ensüümreaktsioone.Jääkide nõuded on ranged.Sisend määrab väljundi;iga kord, kui eesmärk on saada kõrgeima puhtusastmega RNA, läheb see inimestele ja raha maksma.

Proovide kogumine/säilitamine

Lagunemist mõjutavad tegurid Pärast seda, kui proov lahkub elusorganismist/või algsest kasvukeskkonnast, hakkavad proovis olevad endogeensed ensüümid RNA-d lagundama,ja lagunemiskiirus on seotud endogeensete ensüümide sisalduse ja temperatuuriga.Traditsiooniliselt on endogeense ensüümi aktiivsuse täielikuks pärssimiseks ainult kaks võimalust: lisada kohe lüsaat ning homogeniseerida põhjalikult ja kiiresti;lõika väikesteks tükkideks ja külmuta kohe vedelas lämmastikus.Mõlemad lähenemisviisid nõuavad kiiret toimimist.Viimane sobib kõikidele proovidele, esimene aga ainult madala rakkude ja endogeensete ensüümide sisaldusega kudedele, mida on kergem homogeniseerida.Täpsemalt on taimekude, maks, harknääre, kõhunääre, põrn, aju, rasvkude, lihaskude jne enne jätkamist kõige parem külmutada vedela lämmastikuga.

Proovide killustamine ja homogeniseerimine

Lagunemist ja saagikust mõjutavad tegurid Proovi killustatus onpõhjalikuks homogeniseerimiseks, mis on mõeldud RNA täielikuks ja täielikuks vabastamiseks.Rakke saab otse homogeniseerida ilma purustamata.Kudesid saab homogeniseerida alles pärast purustamist.Pärm ja bakterid tuleb enne homogeniseerimist vastavate ensüümidega purustada.Väiksema endogeense ensüümisisaldusega ja kergemini homogeniseeritavaid kudesid saab lüsaadis korraga purustada ja homogeniseerida homogenisaatoriga;taimekude, maks, harknääre, kõhunääre, põrn, aju, rasvkude, lihaskude ja muud proovid, neis on palju endogeenseid ensüüme või neid ei ole lihtne homogeniseerida,seega tuleb kudede katkestamine ja homogeniseerimine läbi viia eraldi.Kõige usaldusväärsem ja produktiivsem killustamismeetod on jahvatamine vedela lämmastikuga ning kõige usaldusväärsem homogeniseerimismeetod on elektrilise homogenisaatori kasutamine.Erimärkus vedela lämmastikuga jahvatamise kohta: proovi ei tohi kogu jahvatusprotsessi ajal üles sulatada, kuna külmunult toimivad endogeensed ensüümid tõenäolisemalt.

Lüsaadi valik

Töömugavuse ja endogeensete jääklisandite tegurite mõjutamine Tavaliselt kasutatavad lüüsilahused võivad RNaasi aktiivsust peaaegu pärssida.Seetõttu on lüüsilahuse valimise põhipunkt seda koos puhastusmeetodiga.On üks erand:kõrge endogeensete ensüümide sisaldusega proovide puhul soovitatakse endogeensete ensüümide inaktiveerimise võime suurendamiseks kasutada fenooli sisaldavat lüsaati.

Puhastusmeetodi valik

Endogeensete lisandite jääkaineid mõjutavad tegurid, ekstraheerimiskiirus Puhaste proovide, näiteks rakkude puhul saab rahuldavaid tulemusi saada peaaegu iga olemasoleva puhastusmeetodiga.Kuid paljude teiste proovide puhul, eriti nende puhul, milles on palju lisandeid, nagu taimed, maks, bakterid jne, on sobiva puhastusmeetodi valimine ülioluline.Kolonni tsentrifugaalpuhastusmeetodil on kiire ekstraheerimiskiirus ja see võib tõhusalt eemaldada lisandid, mis mõjutavad RNA järgnevat ensümaatilist reaktsiooni, kuid see on kallis (Foregene võib pakkuda kulutõhusaid komplekte, lisateavet klõpsake nuppusiin);ökonoomsed ja klassikalised puhastusmeetodid, nagu LiCl sadestamine, võivad samuti saada rahuldavaid tulemusi, kuid tööaeg on pikk..

"Kolm distsipliini ja kaheksa tähelepanu" RNA ekstraheerimiseks

Distsipliin 1:Lõpetage eksogeensete ensüümide saastumine.

Märkus 1:Kandke rangelt maske ja kindaid.

Märkus 2:Katsesse kaasatud tsentrifuugitorud, otsapead, pipetivardad, elektroforeesipaagid ja katselauad tuleb põhjalikult utiliseerida.

Märkus 3:Katses kasutatavad reaktiivid/lahused, eriti vesi, peavad olema RNaasivabad.

Distsipliin 2:Blokeerib endogeensete ensüümide aktiivsust

Märkus 4:Valige sobiv homogeniseerimismeetod.

Märkus 5:Valige sobiv lüsaat.

Märkus 6:Kontrollige proovi algkogust.

Distsipliin 3:Täpsustage oma ekstraheerimise eesmärki

Märkus 7:Kui mis tahes lüsaadisüsteem läheneb proovi maksimaalsele algkogusele, langeb ekstraheerimise õnnestumise määr järsult.

Märkus 8:Ainus majanduslik kriteerium edukaks RNA ekstraheerimiseks on edu järgmistes katsetes, mitte saagis.

RNaasi saastumise 10 parimat allikat

1. Sõrmed on esimene eksogeensete ensüümide allikas, seega tuleb kindaid kanda ja neid sageli vahetada.Lisaks tuleb kanda ka maske, sest ka hingamine on oluline ensüümide allikas.Kinnasmaski kandmise lisaeelis on katsetaja kaitsmine.

2. Pipetiotsad, tsentrifuugitorud, pipetid – RNaasi ei saa inaktiveerida ainult steriliseerimisega, seega tuleks pipetiotsikuid ja tsentrifuugitorusid töödelda DEPC-ga, isegi kui need on märgistatud kui DEPC-ga töödeldud.Parim on kasutada spetsiaalset pipetti, pühkige see enne kasutamist 75% alkoholisisaldusega vatiga, eriti varras;lisaks ärge kindlasti kasutage peaeemaldajat.

3. Vesi/puhver ei tohi olla RNaasi saastatusest vaba.

4. Vähemalt testilaud tuleks 75% alkoholisisaldusega vatitükkidega puhtaks pühkida.

5. Endogeenne RNaas Kõik koed sisaldavad endogeenseid ensüüme, seega on kudede kiire külmutamine vedela lämmastikuga parim viis degradatsiooni vähendamiseks.Vedela lämmastiku säilitamise/jahvatamise meetod on tõepoolest ebamugav, kuid see on ainus võimalus kudede jaoks, kus on kõrge endogeensete ensüümide sisaldus.

6. RNA proovid RNA ekstraheerimisproduktid võivad sisaldada RNaasi saastumise jälgi.

7. Plasmiidi ekstraheerimine Plasmiidi ekstraheerimisel kasutatakse sageli RNA lagundamiseks RNA-d ning jääk-Rnaasi tuleks seedida proteinaas K-ga ja ekstraheerida PCI-ga.

8. RNA säilitamine Isegi kui seda hoitakse madalal temperatuuril, põhjustavad RNaasi jäljed RNA lagunemist.Parim lahendus RNA pikaajaliseks säilitamiseks on soola/alkoholi suspensioon, sest alkohol pärsib madalatel temperatuuridel kogu ensümaatilist aktiivsust.

9. Kui katioonid (Ca, Mg) sisaldavad neid ioone, põhjustab 5 minutiline kuumutamine 80C juures RNA lõhustumist, seega kui RNA-d on vaja kuumutada, peab säilituslahus sisaldama kelaativat ainet (1mM naatriumtsitraat, pH 6,4).

10. Järgmistes katsetes kasutatud ensüümid võivad olla RNaasiga saastunud.

10 näpunäidet RNA ekstraheerimiseks

1: RNaasi aktiivsuse kiire vältimine.Proovid külmutatakse pärast kogumist kiiresti ja RNaasi inaktiveeritakse kiirel tööl lüüsi ajal.

2: Valige kõrge ribosüümisisaldusega koe jaoks sobiv ekstraheerimismeetod ja rasvkoes on kõige parem kasutada fenooli sisaldavat meetodit.

3: ennustamise kvaliteet nõuab Northerni, cDNA raamatukogu konstrueerimine nõuab kõrget terviklikkust ning RT-PCR ja RPA (ribonukleaasi kaitsetest) ei nõua kõrget terviklikkust.RT-PCR nõuab kõrget puhtust (ensüümi inhibiitori jäägid).

4: põhjalik homogeniseerimine on saagikuse parandamise ja lagunemise vähendamise võti.

5: kontrollige RNA elektroforeesi tuvastamise terviklikkust, 28S: 18S = 2: 1 on täielik märk, 1: 1 on samuti vastuvõetav enamiku katsete jaoks.

6: DNA eemaldamine RT-PCR jaoks, massiivi analüüs DNA eemaldamiseks on kõige parem kasutada Dnaas I.

7: Vähendage eksogeensete ensüümide saastumist – ensüüme ei saa väljastpoolt importida.

8: Madala kontsentratsiooniga nukleiinhappe kontsentreerimisel tuleks lisada kaassadestamisreaktiivi.Kuid selleks, et vältida ensüüme sisaldava kaassadestaja ja DNA saastumist.

9: lahustage RNA põhjalikult, vajadusel kuumutage 65C juures 5 minutit.

sobiv ladustamisviis

Säilib –20C juures lühikest aega ja –80C juures kaua.Esimene samm RNA saagise parandamisel on mõista, et erinevate proovide RNA sisaldus on väga erinev.Kõrge sisaldus (2–4 ug/mg), nagu maks, kõhunääre, süda, keskmine arvukus (0,05–2 ug/mg), nagu aju, embrüo, neer, kops, harknääre, munasarjad, madal sisaldus (<0,05 ug/mg) mg), nagu põis, luu, rasv.

1: Lüüsi rakud RN vabastamiseks – kui RNA-d ei vabastata, väheneb saagis.Elektriline homogeniseerimine toimib paremini kui teised homogeniseerimismeetodid, kuid võib osutuda vajalikuks kombineerida ka muude meetoditega, nagu vedela lämmastiku segamine, ensümaatiline lagundamine (lüsosüüm/lütaasi).

2: Ekstraheerimismeetodi optimeerimine.Suurimad probleemid fenoolipõhiste meetodite puhul on mittetäielik kihistumine ja osaline RNA kadu (supernatanti ei saa täielikult eemaldada).Mittetäieliku kihistumise põhjuseks on kõrge nukleiinhapete ja valgusisaldus, mida saab lahendada kasutatava lüsaadi koguse suurendamise või proovi koguse vähendamisega.Rasvkoele lisati kloroformi ekstraheerimise etapp.RNA kadu saab vähendada tagasipumbaga või orgaanilise kihi eemaldamisega, millele järgneb tsentrifuugimine.Suurim probleem kolonntsentrifuugimisel põhinevate meetodite puhul on liigne proov.

Klassikalised ekstraheerimise näpunäited

1. Puhastamine fenooliga: lisage võrdne maht 1:1 fenooli/kloroformi ja segage intensiivselt 1-2 minutit.Tsentrifuugige suurel kiirusel 2 minutit.Eemaldage ettevaatlikult supernatant (80-90%).Ärge kunagi sattuge keskmise kihini.Võrdse koguse reaktsioonilahust võib lisada fenooli/kloroformi segule ja eemaldada supernatant.Neid kahte supernatanti võib saagise parandamiseks nukleiinhapete sadestamiseks omavahel segada.Ärge olge segamisel liiga õrn ja ärge püüdke kogu supernatanti eemaldada.

2. Pesemine 70-80% etanooliga: Pesemise ajal tuleb nukleiinhape suspendeerida, et tagada soolajääkide väljapesemine.Samal ajal tsentrifuugige kohe pärast etanooli äravalamist paar sekundit suurel kiirusel ja seejärel eemaldage pipetiga jääk-etanool.Lahustage pärast 5-10 minutit toatemperatuuril seismist.

11. Eriorganisatsioonide väljatõmbamine

1. Kiuline kude: võti RNA ekstraheerimiseks kiulisest koest, nagu süda/skeletilihas, on koe täielik rikkumine.Nendel kudedel on madal rakutihedus, mistõttu RNA kogus koe massiühiku kohta on väike ja kõige parem on kasutada võimalikult palju algkogust.Peenestage kude kindlasti külmumistingimustes põhjalikult.

2. Kõrge valgu/rasvasisaldusega koed: aju/taimse rasva sisaldus on kõrge.Pärast PCI ekstraheerimist sisaldab supernatant valgeid helbeid.Supernatant tuleb uuesti kloroformiga ekstraheerida.

3. Kõrge nukleiinhapete/ribosüümisisaldusega koed: põrnas/harknääres on kõrge nukleiinhappe- ja ribosüümisisaldus.Kudede jahvatamine külmumistingimustes, millele järgneb kiire homogeniseerimine, võib ribosüüme tõhusalt inaktiveerida.Kui lüsaat on aga liiga viskoosne (kõrge nukleiinhapete sisalduse tõttu), ei saa PCI ekstraheerimine tõhusalt kihistada;lüsaadi lisamine võib selle probleemi lahendada.Mitu PCI ekstraheerimist võib eemaldada rohkem jääk-DNA-d.Kui kohe pärast alkoholi lisamist tekib valge sade, viitab see DNA saastumisele.Pärast lahustamist happelise PCI-ga uuesti ekstraheerimine võib eemaldada DNA saastumise.

4. Taimne kude: taimne kude on keerulisem kui loomkude.Üldiselt jahvatatakse taimi vedela lämmastiku tingimustes, seega on RNA lagunemine endogeensete ensüümide poolt aeg-ajalt.Kui lagunemisprobleemi ei lahendata, on selle põhjuseks peaaegu kindlasti proovis sisalduvad lisandid.Paljudes taimedes sisalduvad lisandid viivad jääkide tekkeni ja jääkide põhjuseks on sageli see, et neil lisanditel on mõningaid sarnasusi RNA-ga: sina sadestute ja mina sadestan ning teie adsorbeerite ja mina adsorbeerin.Need omadused määravad, et need on väga tugevad ensüümi inhibiitorid.

Praegu saab kaubanduslikke RNA ekstraheerimisreaktiive kohandada peaaegu kõikidele loomsetele kudedele väikeste kohandustega, kuid on vähe kaubanduslikke RNA ekstraheerimisreaktiive, mis sobiksid enamiku taimekudede jaoks.Õnneks suudab Foregene pakkuda erilisitaime RNA ekstraheerimise komplektid, meil onPlant Total RNA isolation kit, Plant Total RNA isolatsioonikomplekt Plus.Viimane on mõeldud spetsiaalselt kõrge polüsahhariidide ja polüfenoolide sisaldusega taimedele.RNA ekstraheerimiseks on labori kasutajate tagasiside eriti hea.

12. Proovi külmutamise ja sulatamise mõju Külmutatud proov võib olla suurem ja see tuleb enne RNA ekstraheerimiseks kasutamist lõigata.Proovid kipuvad lõikamise ajal (võimalik, et osaliselt) sulama.Külmutatud proove võib olla vaja enne RNA ekstraheerimist kaaluda ja selle protsessi käigus toimub kindlasti sulatamine.Mõnikord toimub proovi sulatamine ka vedela lämmastiku jahvatamise käigus;või lisatakse külmutatud proov otse lüsaadile ilma vedela lämmastikuga jahvatamiseta ja sulamine toimub kindlasti enne täielikku homogeniseerimist.Katsed on näidanud, et külmutatud koes on sulamise ajal RNA lagunemine suurem kui värskes koes.Tõenäoline põhjus: külmutamise-sulatamise protsess rikub rakusiseseid struktuure, muutes endogeensetel ensüümidel RNA-ga otsese kokkupuute lihtsamaks.

13. RNA kvaliteedi hindamine Tavaliselt kasutatakse RNA terviklikkuse hindamiseks elektroforeesi ja RNA puhtuse hindamiseks A260/A280.Teoreetiliselt on puutumata RNA suhe 28S:18S = 2,7:1 ja enamik andmeid rõhutavad suhet 28S:18S = 2:1.Fakt on see, et peaaegu ükski muudest proovidest peale rakkude ekstraheeritud RNA ei ole vahekorras 2:1 (see saadi Agilent Bioanalyzeri abil).

RNA elektroforeesi tulemusi mõjutavad paljud tegurid, sealhulgas sekundaarstruktuur, elektroforeesi tingimused, proovi koormus, EB küllastusaste jne. Kasutage RNA tuvastamiseks natiivset elektroforeesi ja kasutage kontrollina DNA markerit.Kui 28S 2 kb ja 18S 0,9 kb on selged ja 28S: 18S > 1, võib terviklikkus vastata enamiku järgnevate katsete nõuetele.

A260/A280 on palju segadust tekitanud näitaja.Kõigepealt on vaja selgitada selle indikaatori algset tähendust nukleiinhapete puhul: puhas RNA, selle A260/280 = umbes 2,0.Puhas RNA on "põhjus" ja A260/A280 = 2 on "mõju".Nüüd kasutavad kõik A260/A280 "põhjusena", arvates, et "kui A260/A280 = 2, siis RNA on puhas", mis loomulikult põhjustab segadust.

Kui olete huvitatud, võite oma RNA proovi lisada veidi ekstraheerimisel sageli kasutatavat reaktiivi, nagu fenool, guanidiini isotiotsüanaat, PEG jne, ja seejärel mõõta A260/A280 suhet.Reaalsus on see, et paljud RNA ekstraheerimiseks kasutatavad reaktiivid ja paljud proovis olevad lisandid neelavad ligikaudu A260 ja A280, mõjutades A260/A280.

Praegu on kõige õpetlikum lähenemisviis RNA proovide skannimine vahemikus 200–300 nm.Puhta RNA kõveral on järgmised omadused: kõver on sile, A230 ja A260 on kaks käändepunkti, A300 on 0 lähedal, A260/A280 = umbes 2,0 ja A260/A230 = umbes 2,0.Kui skaneerimisandmed pole kättesaadavad, tuleb määrata ka A260/A230 suhe, kuna see suhe on tundlikum kõigi ensümaatilist reaktsiooni mõjutavate lisandite ülekandumise suhtes.Võtke arvesse seadme lineaarset ulatust (A260 puhul 0,1–0,5).

On veel kaks kasulikku nähtust: suhe on umbes 0,3 madalam, kui A260/A280 mõõdetakse vees;samas kui 10 mM EDTA-s mõõdetud suhe on umbes 0,2 võrra kõrgem kui 1 mM EDTA-s mõõdetud suhe.

Seotud tooted:

Hiina Plant Total RNA isolatsioonikomplekti tootja ja tarnija |Foregene (foreivd.com)

RNA isolatsiooniseeria tarnijad ja tehas |Hiina RNA isolatsiooniseeria tootjad (foreivd.com)

RNA isoleerimise seeria – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)