1. Tuvastage RNA lahuse neeldumine
Neeldumine lainepikkustel 280, 320, 230 ja 260 nm tähistab vastavalt nukleiinhappe, fooni (lahuse hägusus), soola kontsentratsiooni ja orgaanilise aine, näiteks valgu väärtusi.Üldiselt vaadake ainult OD260/OD280 (suhe, R).Kui 1,8–2,0, arvame, et valgu või muu orgaanilise aine saastumine RNA-s on talutav, kuid tuleb märkida, et kui Tris-i kasutatakse puhvrina neeldumise tuvastamiseks, võib R väärtus olla suurem kui 2 (tavaliselt peaks see olema <2,2).Kui R<1,8, on valgu või muu orgaanilise aine saastumine lahuses ilmsem ning RNA saatust saab määrata vastavalt vajadusele.Kui R>2,2, tähendab see, et RNA on hüdrolüüsitud üheks nukleiinhappeks.
2. RNA elektroforeetiline muster
Üldjuhul kasutatakse RNA elektroforeesiks denatureerivat geeli, kuid kui see on ainult RNA kvaliteedi tuvastamiseks, ei ole denatureeriv geel vajalik ning võib kasutada tavalist agaroosgeeli.Elektroforeesi eesmärk on tuvastada 28S ja 18S ribade terviklikkus ja nende suhe ehk mRNA määrdumine.Üldiselt, kui 28S ja 18S ribad on heledad, selged ja teravad (viidates, et ribade servad on selged) ja 28S heledus on rohkem kui kaks korda suurem kui 18S ribal, peame RNA kvaliteeti heaks.
Ülaltoodud on kaks meetodit, mida me tavaliselt kasutame, kuid kumbki neist kahest meetodist ei saa meile selgelt öelda, kas RNA lahuses on RNaasi jääk.Kui lahuses on väga väike kogus RNaasi, on meil seda ülaltoodud meetodiga raske tuvastada, kuid enamik järgnevaid ensümaatilisi reaktsioone viiakse läbi temperatuuril üle 37 kraadi ja pikka aega.Sel moel, kui RNA lahuses on väga väike kogus RNaasi, siis on järgnevates katsetes väga sobiv keskkond ja aeg oma rolli mängida ning loomulikult on katse sel ajal külm.Allpool tutvustame meetodit, mis võib kinnitada, kas RNA lahuses on RNaasi jääk.
3. Kuumuse säilivuse katse
Vastavalt proovi kontsentratsioonile tõmmake RNA lahusest kaks 1000 ng RNA-d ja lisage see 0,5 ml tsentrifuugi katseklaasi ning lisage pH 7,0 Tris puhvriga kogumahuni 10 ul ja seejärel sulgege katseklaasi kork.Pange üks neist püsiva temperatuuriga 70°C veevanni ja hoidke 1 tund soojas.Teist osa hoiti -20°C külmkapis 1 tund.Kui aeg on täis, eemaldage kaks proovi elektroforeesiks.Pärast elektroforeesi lõppu võrrelge nende kahe elektroforeetilisi ribasid.Kui nende kahe ribad on järjepidevad või neil puudub oluline erinevus (loomulikult vastavad nende ribad ka meetodi 2 tingimustele), tähendab see, et RNA lahuses ei ole RNaasi jääksaastet ja RNA kvaliteet on väga hea.Vastupidi, kui 70 °C juures inkubeeritud proov näitab ilmset lagunemist, näitab see, et RNA lahuses on RNaasi saastumine.
2 RNA ekstraheerimise katsemeetodid ja tehnikad
Probleemid, millega RNA ekstraheerimisel sageli kokku puutume, on järgmised: (1) RNA saagis on madal;(2) RNA-l on tõsine soolareostus;(3) RNA-l on tõsine orgaaniliste lahustite reostus;(4) proovi lagunemine ja muud probleemid
1. Tavaliselt kasutatavad totaalse RNA ekstraheerimise reagendid
Guanidiini isotiotsüanaadi meetod ja Trizoli meetod on loomsetest kudedest ja loomarakkudest kogu RNA ekstraheerimiseks kõige sagedamini kasutatavad meetodid.See sobib eriti hästi väikeste proovide ja kudede jaoks, mida on eriti raske ekstraheerida, näiteks kogu RNA ekstraheerimiseks küüliku nahast ja loomade sidekoest;lisaks saab Trizoli üldotstarbelise lüüsireagendina kasutada ka taimekudede, bakterite, seente ja muude kudede ekstraheerimiseks.Polüsahhariide ja polüfenoole sisaldavate taimekudede puhul, nagu Camellia oleifera, teelehed, rapsiseemned jne, saab CTAB-meetodit kasutada ka kogu RNA ekstraheerimiseks.
Tavameetodina on kahekolonniline meetod väga populaarne ka selle normaalse temperatuuri töötamise, RNaasi lisamise puudumise ja ohutuse tõttu – ekstraheerimiseks ei kasutata kloroformi, fenoole ega muid orgaanilisi reaktiive.(soovitatavad tooted )
2. Kogu RNA ekstraheerimine loomsetest kudedest
(1) Proovige valida värsket salvrätikut, kui see pole värske (soovitavalt kolme kuu jooksul - 80 ℃ külmkapis või vedelas lämmastikus külmutatud. Koe lõikamisel ärge lõigake otse toatemperatuuril, pange see kindlasti jääkastile, püüdke vältida korduvat külmutamist ja sulatamist.
(2) Kasutage väikese koetüki lõikamiseks puhtaid kääre ja pintsette, proovi lõikamisel proovige lõigata koe keskosa või lõigake esmalt suur koetükk keskelt ja seejärel lõigake proov värske sisselõike kohas.Eemaldatud kude tuleks täielikult purustada, panna purustatud kude ilma RNaasita EP katsutisse, lisada lüsaat, purustatud kude tuleks täielikult lüsaadiga kokku puutuda ja valmistuda homogeniseerimiseks.
(3) Normaalsete kudede jaoks valige homogeniseerimiseks mungoasuurused koed (30–60 mg).Kui koed sisaldavad suures koguses valku, rasva või tihedaid kiulisi kudesid, nagu maks, suurendage või vähendage vastavalt lõigatud kudede hulka (valikuline) Valige 10–20 mg).
(4) Kui ekstraheeritakse kalalihast, krevetiliha, meduusid ja muid suure veesisaldusega kudesid, tuleks proovi mahtu vastavalt suurendada (soovitatav 100–200 mg).
(5) Kui tingimused seda võimaldavad, võib loomset kude vahetult ekstraheerida pärast homogeniseerimist suure läbilaskevõimega koehomogenisaatoriga, kui sellised seadmed puuduvad.
(6) Pärast lõplikku ekstraheerimist saadud RNA tuleb koheselt asetada jääkasti, et vähendada RNA lagunemist.
3. Loomarakkude RNA ekstraheerimine
(1) Suspensioonirakud: tsentrifuugige otse ja visake sööde ära, peske steriilse PBS-iga 1–2 korda, seejärel suspendeerige sobiva koguse PBS-iga ja lisage lüüsiks lüsaat.Ärge lisage lüsaati otse sadestunud rakkudesse pärast vedeliku täielikku äraviskamist.See põhjustab pärast väliskihi lüüsitud rakkude vabanemist histooni pakendi kleepumist sadestunud rakkude välisküljele, piirates seeläbi pelleti sees olevate rakkude kokkupuudet lüsaadiga., mille tulemuseks on rakkude mittetäielik lüüs ja vähenenud RNA saagis.
(2) Rakud, mis on poolkleepuvad või mitte tihedalt kleepuvad: pärast söötme äraviskamist peske 1–2 korda PBS-iga, seejärel absorbeerige otse sobiv kogus PBS-i ja puhuge kultiveerimisnõu pipeti või püstoliga, et rakud ära puhuda ja viia need RNA-vabadesse rakkudesse.Lisage lüsaat ekstraheerimiseks ensüümi EP katseklaasi.
(3) Kleepuvad rakud: tuleb esmalt seedida trüpsiiniga, seejärel koguda RNaasi-vabadesse EP katseklaasidesse, supernatandi eemaldamiseks tsentrifuugida, üleliigse trüpsiini eemaldamiseks pesta 1–2 korda PBS-iga ja resuspendeerida sobiva koguse PBS-iga. Seejärel jätkake ekstraheerimisetapiga.
4. Taime RNA ekstraheerimine
Taimekoed on rikkad fenoolsete ühendite või polüsahhariidide poolest või sisaldavad tuvastamata sekundaarseid metaboliite või neil on kõrge RNaasi aktiivsus.Need ained on pärast rakkude lüüsimist tihedalt ühendatud RNA-ga, moodustades lahustumatud kompleksid või kolloidsed sademed, mida on raske eemaldada.Seetõttu peame taimekoe ekstraheerimisel valima taimede jaoks komplekti.Komplektis olev lüsaat võib tõhusalt lahendada polüfenoolide lihtsa oksüdatsiooni ning polüsahhariidühendite ja nukleiinhapete eraldamise probleeme.
(Polüsahhariidpolüfenooli taime RNA ekstraheerimiseks soovitatavad tooted:
(1) Taime koor, viljaliha, seemned, lehed jne tuleb uhmris täielikult jahvatada.Jahvatusprotsessi ajal tuleks vedelat lämmastikku õigeaegselt lisada, et vältida proovi sulamist.Jahvatatud proov tuleks kiiresti lüsaadile lisada ja RNA lagunemise vältimiseks loksutada.
(2) Kiudainerikaste proovide, nagu riisi ja nisu lehtede puhul, tuleks ekstraheerimise kogust asjakohaselt vähendada, vastasel juhul ei toimu koe jahvatamine ja lüüs täielikult, mille tulemuseks on ekstraheeritud RNA madal saagis.
(3) Suure veesisaldusega taimekudede puhul, nagu granaatõuna viljad, arbuusi viljad, virsiku viljad jne, tuleks proovi suurust vastavalt suurendada (100–200 mg on valikuline).
(4) Taimekudedes, nagu taimelehed, risoomid, kõvad viljad ja muud materjalid, on üldiselt soovitatav kasutada vedelat lämmastikku, et mördi koostisained põhjalikult mördida ja seejärel jätkata ekstraheerimisetapiga.Tavalised koehomogenisaatorid ei pruugi olla taimekudede homogeniseerimisel tõhusad ja neid ei soovitata üldiselt kasutada.
5. Ettevaatusabinõud RNA ekstraheerimiseks
(1) Koeproovid peaksid olema võimalikult värsked, et vältida korduvat külmutamist ja sulatamist.
(2) Kude peab ekstraheerimise ajal olema täielikult jahvatatud ja koe kogus ei tohiks olla liiga väike, rääkimata liiga palju.
(3) Pärast lüsaadi lisamist tuleks anda piisav inkubatsiooniaeg proovi täielikuks lüüsimiseks.
(4) Kui kasutatakse ekstraheerimiseks Trizoli meetodit, on supernatandi neelamise põhimõte pärast kihistamist "eelistatakse vähem sissehingamist kui rohkem" ja see ei tohi ekstraheerida keskmisesse kihti, vastasel juhul põhjustab see tõsist genoomse DNA saastumist.
(5) Pesemisel peaks pesuvedelik imbuma täielikult ümber toru seina, et tagada põhjalik pesemine.
(6) Kolonni ekstraheerimise meetodi puhul tuleks adsorptsioonikolonn lisaks kolonni eemaldamisele pärast pesemist asetada ka ülipuhtale pingile ja puhuda 5–10 minutit, et orgaaniline lahusti täielikult kuivaks aurustuks.
(7) Kolonnmeetodi viimasel elueerimisel, pärast DEPC vee lisamist, tuleks seda inkubeerida 3–5 minutit või kuumutada DEPC vett eelnevalt temperatuurini 60 °C, et suurendada elueerimise saagist.Traditsioonilise Trizoli lõhustamise ja isopropanooliga sadestamise meetodi puhul lahustatakse lõplik RNA DEPC vees, seega tuleks lahustamiseks anda sobiv aeg ja tsentrifuugitoru põhja tuleb pipetiotsaga pidevalt puhuda.
3 TKolm Madala RNA kontsentratsiooni / halva kvaliteedi põhjused ja lahendused
1. Saagis on liiga madal
Ekstraheeritud proov on liiga madal, üldkogus on ebapiisav või ekstraheeritud proovi on liiga palju ja lüüs ei ole täielik;ekstraheerimiseks tuleks kasutada sobiva kvaliteediga kude või rakke, proovi eeltöötlemine peab olema hästi tehtud ja lüüsimine peaks olema piisav.
2. Genoomi jäägid
Trizoli meetodil ekstraheerimisel, kui supernatant imetakse pärast kihistamist keskmisesse kihti, tekib tõsine genoomi saastumine;Kihitamisel tuleks olla eriti ettevaatlik, et vältida keskmisesse kihti imemist.Kui ekstraheerimiseks kasutatakse kolonnmeetodit, võib ekstraheerimiseks valida komplekti, mis sisaldab DNaas I.Membraanile adsorbeeritud nukleiinhapet seeditakse otse DNaas I-ga, mis võib oluliselt vähendada DNA jääke.
3. RNA lagunemine
See võib olla ekstraheeritud proovi enda lagunemine või ekstraheerimisprotsessi käigus tekkinud lagunemine;Võimaluse korral tuleks RNA ekstraheerimiseks kasutada värskeid proove ning kogutud proove õigeaegselt hoida vedelas lämmastikus või -80°C külmikus ning vältida korduvat külmutamist ja sulatamist.RNA ekstraheerimise protsessis tuleks kasutada RNaasi/DNaasi vaba otsikuid, tsentrifuugitorusid ja muid materjale.Ekstraheerimisprotsess peaks olema võimalikult kiire.Ekstraheeritud RNA tuleks asetada jääkasti ja säilitada -80 °C juures.Kui ekstraheeritud RNA-d on vaja tuvastada geelelektroforeesiga, tuleb kohe pärast ekstraheerimist läbi viia elektroforees ja asendada elektroforeesipuhver äsja valmistatud puhverlahusega.
4. Soola ja orgaaniliste lahustite jäägid
Ekstraheerimisreagendid sisaldavad fenooli ja guanidiini sooli ning pesulahus etanooli.Ekstraheerimisprotsessi ajal ei imendunud lüsaat täielikult ega visatud ära ning pesulahus ei kuivanud täielikult.Järelejäänud soolad ja orgaanilised lahustid on kahjulikud järgnevale pöördtranskriptsioonile ja PCR-ile.Erinevad inhibeerimisastmed, nii et koelüsaat tuleks ekstraheerimise käigus täielikult eemaldada ja pesemine peaks olema piisav, et toru ümbritsevaid seinu saaks pesta.Lisaks on toru tühjendamine ja puhumine vajalik samm, mis vähendab veelgi orgaanilise aine jääke.
RNA ekstraheerimise kohta lisateabe saamiseks järgige meie veebisaiti:
Lisateabe saamiseks www.foreivd.com.
Postitusaeg: detsember 01-2022
