On hästi teada, et keskses dogmas on RNA transkriptsiooniline vahendaja DNA ja valgu ekspressiooni vahel.Võrreldes DNA tuvastamisega võib RNA tuvastamine objektiivsemalt kajastada geeniekspressiooni organismides.RNA-ga seotud katsed hõlmavad järgmist: qRT-PCR, RNA-Seq ja fusioongeenide tuvastamine jne. RNA enda omaduste põhjal (RNA suhkruringis on üks vaba hüdroksüülrühm rohkem kui DNA suhkruringis), mis on seotud suure hulga RNaasidega keskkonnas, on RNA ebastabiilsem ja kergemini lagunev kui DNA.Prügi sisse, prügi välja, kui RNA kvaliteet ei ole hea, siis peavad katsetulemused olema mitterahuldavad, mis väljenduvad konkreetselt ebatäpsete andmete või halva korratavusega.Seetõttu tuleks rohkem tähelepanu pöörata RNA töötlemisele, samuti on olulisem kvaliteedikontrolli seos, et tagada hilisemate katseandmete täpsus ja õigsus.

RNA kvaliteedi kontrollimiseks kasutatakse tavaliselt järgmisi meetodeid:

• Spektrofotomeetria
• agaroosgeeli elektroforees
• Agilent bioanalüsaator
• reaalajas fluorestseeruv kvantitatiivne PCR
• Qubit fluorestsentsvärvi meetod

01 Spektrofotomeetria

RNA-l on konjugeeritud kaksiksidemed ja selle neeldumispiik on lainepikkusel 260 nm.Lambert-Beeri seaduse kohaselt saame RNA kontsentratsiooni arvutada neeldumispiigist 260 nm juures.Lisaks saame arvutada ka RNA puhtuse vastavalt 260nm, 280nm ja 230nm neeldumispiikide suhtele.280 nm ja 230 nm on vastavalt valkude ja väikeste molekulide neeldumispiigid.Kvalifitseeritud RNA puhtuse A260/A280 ja A260/A230 suhe peaks olema suurem kui 2. Kui see on väiksem kui 2, tähendab see, et RNA proovis on valk või väikemolekulaarne saastumine ja seda tuleb uuesti puhastada.Saasteallikad mõjutavad allavoolu katseid, näiteks inhibeerivad PCR-reaktsioonide amplifikatsioonitõhusust, mille tulemuseks on ebatäpsed kvantitatiivsed tulemused.RNA puhtusel on suur mõju järgnevatele tulemustele, seega on spektrofotomeetria nukleiinhappekatsete esimeses etapis üldiselt asendamatu kvaliteedikontrolli lüli.

Joonis 1. Tüüpiline RNA/DNA absorptsioonispekter

02 Agaroosgeeli elektroforees

Lisaks puhtusele on RNA terviklikkus ka üks olulisi näitajaid RNA kvaliteedi hindamisel.RNA lagunemine toob kaasa suure hulga lühikesi fragmente proovis, seega väheneb tõhusalt tuvastatavate ja võrdlusjärjestusega hõlmatavate RNA fragmentide arv.RNA terviklikkust saab kontrollida kogu RNA elektroforeesiga 1% agaroosgeelil.Selle meetodi abil saab geeli ise konfigureerida või kasutada terviklikkuse testimiseks kokkupandavat E-Gel™ süsteemi.Rohkem kui 80% kogu RNA-st on ribosomaalne RNA, millest suurem osa koosneb 28S ja 18S rRNA-st (imetajate süsteemides).Hea kvaliteediga RNA näitab kahte selget eredat riba, mis on vastavalt 28S ja 18S eredad tulbad, 5 Kb ja 2 Kb juures ning suhe kipub olema 2:1 lähedal.Kui see on hajusas olekus, tähendab see, et RNA proov võib olla lagunenud ja RNA kvaliteedi edasiseks testimiseks on soovitatav kasutada hiljem kirjeldatud meetodit.

Joonis 2. Lagunenud (rada 2) ja puutumata RNA (rada 3) võrdlus agaroosgeeli elektroforeesil

03 Agilent Bioanalyzer

Lisaks ülalkirjeldatud agaroosgeelelektroforeesi meetodile, mis aitab meil lihtsalt ja kiiresti tuvastada RNA terviklikkust, saame RNA terviklikkuse määramiseks kasutada ka Agilent bioanalüsaatorit.See kasutab RNA kontsentratsiooni ja terviklikkuse hindamiseks mikrofluidika, kapillaarelektroforeesi ja fluorestsentsi kombinatsiooni.Kasutades RNA proovi profiili analüüsimiseks sisseehitatud algoritmi, saab Agilent bioanalüsaator arvutada RNA terviklikkuse võrdlusväärtuse, RNA terviklikkuse numbri (edaspidi RIN) [1].Mida suurem on RIN väärtus, seda suurem on RNA terviklikkus (1 on äärmiselt lagunenud, 10 on kõige täielikum).Mõned RNA-d hõlmavad katsed soovitavad kasutada kvaliteedi hindamise parameetrina RIN-i.Võttes näitena suure läbilaskevõimega sekveneerimiskatseid (edaspidi NGS), näitavad Oncomine™ Human Immune Repertuaari juhised, mida kasutatakse B-raku ja T-raku antigeeni retseptorite tuvastamiseks Thermo Fisheri Oncomine'i paneeliseerias, et proove, mille RIN väärtus on suurem kui 4, saab mõõta tõhusamaid lugemisi ja kloone3 (Figure).Erinevate paneelide jaoks on erinevad soovitatavad vahemikud ja sageli võib kõrgem RIN tuua tõhusamaid andmeid.

Joonis fig 3, Oncomine™ Human Immune Repertuaari katsetes suudavad proovid, mille RIN on suurem kui 4, tuvastada tõhusamaid lugemisi ja T-raku kloone.【2】

Kuid RIN-i väärtusel on ka mõned piirangud.Kuigi RIN-il on kõrge korrelatsioon NGS-i katseandmete kvaliteediga, ei sobi see FFPE proovide jaoks.FFPE proove on pikka aega keemiliselt töödeldud ja ekstraheeritud RNA-l on üldiselt suhteliselt madal RIN-väärtus.See aga ei tähenda, et katse efektiivsed andmed peavad olema mitterahuldavad.FFPE proovide kvaliteedi täpseks hindamiseks peame kasutama muid mõõtmisi kui RIN.Lisaks RIN-ile saab Agilent bioanalyzer arvutada RNA kvaliteedi hindamisparameetrina ka DV200 väärtuse.DV200 on parameeter, mis arvutab suuremate kui 200 bp fragmentide osakaalu RNA proovis.DV200 on parem FFPE proovi kvaliteedi näitaja kui RIN.FFPE abil ekstraheeritud RNA puhul on sellel väga kõrge korrelatsioon tõhusalt tuvastatavate geenide arvu ja geenide mitmekesisusega [3].Kuigi DV200 suudab korvata FFPE kvaliteedi tuvastamise puudujääke, ei suuda Agilent bioanalüsaator siiski põhjalikult analüüsida RNA proovide kvaliteediprobleeme, sealhulgas seda, kas proovides on inhibiitoreid.Inhibiitorid ise võivad mõjutada allavoolu katsete võimendamise efektiivsust ja vähendada kasulike andmete hulka.Et teada saada, kas proovis on inhibiitor, saame kasutada reaalajas fluorestsents-kvantitatiivset PCR-meetodit, mida kirjeldatakse allpool.

04 reaalajas fluorestseeruv kvantitatiivne PCR

Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR-meetod ei suuda mitte ainult tuvastada proovis olevaid inhibiitoreid, vaid kajastada täpselt ka RNA kvaliteeti FFPE proovis.Võrreldes Agilenti bioloogiliste analüsaatoritega on reaalajas fluorestsents-kvantitatiivsed instrumendid suuremates bioloogilistes laborites nende laiema kasutusala tõttu populaarsemad.RNA proovide kvaliteedi testimiseks peame ostma või valmistama ainult sisemiste võrdlusgeenide, näiteks GUSB (katnr. Hs00939627) praimersondid.Kasutades seda praimerite, sondide ja standardite komplekti (teadaoleva kontsentratsiooniga kogu-RNA) absoluutsete kvantitatiivsete katsete läbiviimiseks, saab efektiivse RNA fragmendi kontsentratsiooni arvutada RNA kvaliteedi hindamisstandardina (lühidalt funktsionaalne RNA kvantitatsioon (FRQ)).NGS-testis leidsime, et RNA proovide FRQ-l on väga kõrge korrelatsioon efektiivse andmemahuga.Kõigi proovide puhul, mis on suuremad kui 0,2 ng/uL FRQ, suudab vähemalt 70% lugemitest tõhusalt katta võrdlusjärjestuse (joonis 4).

Joonisel 4 on fluorestsents-kvantitatiivse meetodiga tuvastatud FRQ väärtusel väga kõrge korrelatsioon (R2>0,9) NGS-katses saadud efektiivsete andmetega.Punane joon on FRQ väärtus, mis on võrdne 0,2 ng/uL (log10 = -0,7).【4】

Lisaks sellele, et reaalajas kvantitatiivne PCR meetod on rakendatav FFPE proovide suhtes, saab see ka tõhusalt jälgida proovides sisalduvaid inhibiitoreid.Saame lisada tuvastatava proovi reaktsioonisüsteemi sisemise positiivse kontrolli (IPC) ja selle analüüsiga ning seejärel teostada fluorestsentsi kvantifitseerimist, et saada Ct väärtus.Kui proovivaba reaktsiooni Ct väärtus jääb Ct väärtusest maha, näitab see, et proovis on inhibiitor ja see pärsib reaktsiooni amplifikatsiooni efektiivsust.

05 Qubit fluorestsentsvärvi meetod

Qubit Fluorometer on kõige sagedamini kasutatav väikeseade nukleiinhapete kontsentratsiooni ja puhtuse tuvastamiseks, mida on lihtne kasutada ja mis on olemas peaaegu igas molekulaarbioloogia laboris.See arvutab täpselt nukleiinhappe kontsentratsiooni, tuvastades ja nukleiinhapet siduva fluorestsentsvärvi (Qubit detection reagent).Qubit on kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega ning suudab RNA-d täpselt kvantifitseerida kuni pg/µL kontsentratsioonini.Lisaks üldtuntud nukleiinhapete kontsentratsiooni täpse kvantifitseerimise võimalusele suudab Thermo Fisheri uusim uus mudel Qubit 4.0 tuvastada ka RNA terviklikkust.Qubit 4.0 RNA tuvastamise süsteem (RNA IQ Assay) tuvastab RNA terviklikkuse, tuvastades samaaegselt kahte spetsiifilist fluorestseeruvat värvainet.Need kaks fluorestseeruvat värvainet võivad seonduda vastavalt RNA suurte fragmentide ja väikeste fragmentidega.Need kaks fluorestseeruvat värvainet näitavad RNA suurte fragmentide osakaalu proovis ja selle põhjal saab arvutada RNA kvaliteeti esindava IQ (Integrity and Quality) väärtuse.IQ väärtus on rakendatav nii FFPE kui ka mitte-FFPE proovide puhul ning sellel on suur mõju järgnevale sekveneerimise kvaliteedile.Võttes näiteks NGS-katsed, siis Ion torrent™ platvormil tehtud RNA-Seq testkatsetes oli enamikul proovidel, mille IQ väärtused olid üle 4, vähemalt 50% efektiivsed lugemised (joonis 5).Võrreldes ülalmainitud tuvastamismeetoditega ei ole Qubit IQ Assay mitte ainult mugavam kasutada ja võtab vähem aega (viie minuti jooksul), vaid sellel on ka suur korrelatsioon mõõdetud parameetri IQ väärtuse ja allavoolu katsete andmekvaliteedi vahel.

Joonisel 5 on suur korrelatsioon Qubit RNA IQ väärtuse ja RNA-Seq kaardistatud lugemiste vahel.【5】

Ülaltoodud sissejuhatuse kaudu usun, et igaühel on piisav arusaam erinevatest RNA kvaliteedikontrolli meetoditest.Praktikas saate validavastav meetod vastavalt valimitüübile ja olemasolevatele instrumentidele.Ainult RNA kvaliteeti hästi kontrollides saame vältida järgnevate katsete ebaõnnestumist, mis on põhjustatud proovide halvast kvaliteedist, säästes nii väärtuslikku aega, energiat ja kulusid.

Võrdlustooted:

Animal Total RNA isolation Kit

Cell Total RNA isolation Kit

viited

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: RNA terviklikkuse number RNA mõõtmistele terviklikkuse väärtuste määramiseks.BMC Molecular Biol. 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertuaari kasutusjuhend (väljaande nr MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, arhiveeritud formaliiniga fikseeritud parafiiniga manustatud koeproovidest tuletatud RNA hindamise täiustatud kvaliteedimeetrid lk 357–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/