RT-qPCR eksperiment sisaldab RNA ekstraheerimist ja kvaliteedi hindamist, pöördtranskriptsiooni ja qPCR kolme etappi, igal etapil on palju ettevaatusabinõusid, tutvustame allpool üksikasjalikult.

Ⅰ.RNA kvaliteedi hindamine

RT-qPCR katses tuleb pärast RNA ekstraheerimise lõpetamist hinnata RNA kvaliteeti ja järelkatset saab läbi viia alles pärast selle kvalifitseerimist.Hindamismeetodite hulka kuuluvad spektrofotomeeter, Agilent geelelektroforees, Agilent 2100 analüüs, mille hulgas on kõige sagedamini kasutatav spektrofotomeeter ja agaroosgeelelektroforeesi meetod.Tuleb märkida, et neid kahte meetodit tuleb RNA kontsentratsiooni, puhtuse ja terviklikkuse tuvastamise ja analüüsi lõpuleviimiseks kasutada koos, et tagada RNA kvaliteet.

Seotud RNA isolatsioonikomplekt: 

Cell Total RNA isolation Kit

Kõrgelt puhastatud ja kvaliteetset kogu-RNA-d saab erinevatest kultiveeritud rakkudest 11 minutiga.

Animal Total RNA isolation Kit

Eraldage kiiresti ja tõhusalt kõrge puhtusastmega ja kvaliteetset kogu-RNA-d erinevatest loomsetest kudedest.

Spektrofotomeeter:

Spektrofotomeetrit kasutatakse peamiselt RNA kontsentratsiooni ja puhtuse määramiseks, kuid see ei suuda tuvastada RNA ja genoomse jäägi terviklikkust.Nende hulgas on A260/280 ja A260/230 olulised parameetrid RNA puhtuse tuvastamisel ning RNA puhtust saab tuvastada vastavalt nende väärtuste kõikumisele:

1. 1,9< A260/280< 2,1, mis näitab, et RNA puhtus on hea;A260/280<1,9, mis näitab, et RNA-s võib olla valgujääke;A260/280>2.1, mis näitab RNA võimalikku osalist lagunemist, mida saab täiendavalt kinnitada agaroosgeelelektroforeesiga.

2. 2,0< A260/230< 2,2, mis näitab, et RNA puhtus on hea;A260/230< 2,0, mis näitab, et RNA-s võib olla orgaaniliste reaktiivide jääke, nagu fenoole, etanooli või suhkruid.

Agaroosgeeli elektroforees:

Agaroosgeeli elektroforeesi test võib analüüsida RNA terviklikkust, genoomi ja valgujääke, kuid ei suuda täpselt määrata RNA kontsentratsiooni ega tuvastada orgaaniliste reaktiivide jääke.Võtke näiteks eukarüootsed RNA mallid:

1. RNA-le viidi agaroosgeelelektroforees.Kui geelikaardil oli ainult kolm üksikut 28sRNA, 18sRNA ja 5,8sRNA riba, näitab see, et ekstraheeritud RNA on puutumatu.Kui esineb lohisevat nähtust, näitab see RNA osalist lagunemist.

2. Kui liimiaugu ja 28sRNA riba vahel on üks hele riba, võib seal olla genoomse DNA jääk.

3. Kui liimiavasse ilmuvad triibud, näitab see, et seal võib olla valkude ja muude makromolekulaarsete ainete jääke.

Ⅱ. Pöördtranskriptsioon

Pärast RNA ekstraheerimise lõpetamist tuleb see järgmisteks katseteks muuta cDNA-ks, seega on ümberpööramise samm hädavajalik.Pöördtranskriptsioon võetakse kasutusele pöördtranskriptaasi ja praimeri valikust:

Pöördtranskriptaasi valik:

Tüüpilised pöördtranskriptaasid hõlmavad AMV RTaasi ja MMLV RTaasi.AMV RTaasi RNaasil H on tugev aktiivsus, lühike sünteesi pikkus, madal sünteesi kogus ja hea termiline stabiilsus (42 ~ 55 ℃).MMLV RTaasi RNaasi H aktiivsus on nõrk, sünteesi pikkus on pikk, sünteesi kogus on suur ja termiline stabiilsus halb (37 ~ 42 ℃).

Kuna RNaas H ensüümil on RNA matriitsi lagundamise funktsioon, tuleks pöördtranskriptsiooni käigus eelistatavalt valida nõrga RNaasi H aktiivsusega MMLV ja pärast hilisemat geenitehnoloogiat on MMLV termiline stabiilsus saavutanud kvalitatiivse hüppe.Foregene võtmineForeasy pöördtranskriptaas (M-MLV pöördtranskriptsiooni jaoks) näiteks on see uus pöördtranskriptaas, mida ekspresseeritakse geneetilise rekombinatsiooni tehnoloogia abil E. coli konstrueeritud bakterites.See on rekombinantne DNA polümeraas, mis sünteesib komplementaarse DNA ahela üheahelalisest RNA-st, DNA-st või RNA:DNA hübriidist.Sellel puudub RNaas H aktiivsus, tugev stabiilsus, tugev RNA afiinsus ja kõrge tuvastamistundlikkus.

 

Foreasy pöördtranskriptaas (M-MLV pöördtranskriptsiooni jaoks)

Praimeri valik:

Üldiselt jagunevad RT-praimerid kolme kategooriasse: oligo-dT, juhuslikud praimerid ja geenispetsiifilised praimerid.Valige kasutamiseks sobivad praimerid vastavalt erinevatele katsenõuetele.

1. Kui matriits on eukarüootset päritolu ja rutiinseks PCR amplifikatsiooniks kasutatakse hilist cDNA-d, on soovitatav kasutada Oligo (dT);Kui järgnevat katset kasutatakse ainult qPCR jaoks, soovitatakse pöördtranskriptsiooni tõhususe parandamiseks segada Oligo (dT) juhuslike praimeritega.

2. Kui matriits pärineb prokarüootidest, tuleks pöördtranskriptsiooniks valida Random Praimerid või geenispetsiifilised praimerid.

Ⅲ.qPCR

Fluorestsentsi kvantifitseerimine on peamiselt välja töötatud kvantitatiivsete meetodite, praimeri kujundamise põhimõtete, ROX valiku, reaktsioonisüsteemi konfiguratsiooni ja reaktsioonitingimuste seadmise jne põhjal.

Kvantitatiivsete meetodite valik:

Kvantitatiivsed meetodid jagunevad suhtelisteks kvantitatiivseteks ja absoluutseks kvantitatiivseteks meetoditeks.Suhtelise kvantifitseerimise abil saab tuvastada teatud ravimeetodite mõju geeniekspressioonile, tuvastada geeniekspressiooni erinevust erinevatel aegadel ja võrrelda geeniekspressiooni erinevust erinevates kudedes.Absoluutne kvantifitseerimine võimaldab tuvastada nukleiinhappe kogust viiruses ja nii edasi.Katsete tegemisel peame valima sobivad kvantitatiivsed meetodid vastavalt meie enda tehtud katsetele.

Krundi kujundamise põhimõtted:

qPCR-i praimeri disain on otseselt seotud amplifikatsiooni efektiivsuse ja toote spetsiifilisusega.Seetõttu on eduka qPCR esimene samm heade praimerite korrektne kujundamine.Krundi projekteerimisel tuleks tavapärase krundi disaini põhimõtte täitmisel pöörata tähelepanu järgmistele põhimõtetele:

1. Sihtmärgifragmendi pikkus on vahemikus 100 kuni 300 aluspaari;

2. Rist-eksoni disain, et vältida genoomse DNA mõju;

3. Kavandatud praimereid tuleb testida amplifikatsiooni efektiivsuse osas ja ainult siis, kui amplifikatsiooniefektiivsus jõuab standardini (90-110%), saab neid kasutada kvantitatiivseteks katseteks;

4. Praimeri kontsentratsioon on tavaliselt optimeeritud vahemikus 0,1 uM kuni 1,0 uM.

ValikROX:

Kvantitatiivse reaktsiooni käigus saab ROX ühtlaselt reguleerida aurustumisest ja kondenseerumisest põhjustatud optilise tee erinevust, pipeteerimisviga või mahu erinevust, parandades tulemuste korratavust.Siiski tuleb märkida, et ROX-i valik on seotud instrumendiga.Kui qPCR-instrumendil on aukude vahe automaatse korrigeerimise funktsioon, ei pea see ROX-i lisama;vastasel juhul peab see lisama ROX-i paranduse.Väikesed partnerid reaktiivide ostmisel peavad õige ROX-i valimiseks lähtuma kasutatavast instrumendist, vältige hilisemaid vigu.

Reaktsioonisüsteemi ettevalmistamine:

Eelistatavad reaktsioonimahud on 20 ul ja 50 ul.Süsteemi koostamisel tuleks tähelepanu pöörata järgmistele asjaoludele:

1. Reaktsioonisüsteem tuleb ette valmistada ülipuhta töölaua ventileerimise teel, uus ddH₂Iga katse jaoks kasutatakse O;

2. Iga katse jaoks tuleb ette valmistada NTC, et kontrollida, kas süsteemis on reostust, ja iga praimerite paar peab süsteemi ettevalmistamisel tegema NTC;

3. Et tuvastada, kas RNA matriitsis on gDNA jääki, saab iga proovi jaoks ette valmistada NRT tuvastamiseks;

4. Süsteemi ettevalmistamisel on soovitatav teha ühe proovi kohta vähemalt 3 tehnilist kordust;

5. Kui matriitsiks on cDNA, on soovitatav lahjendada 5-10 korda, et vähendada pöördtranskriptsioonisüsteemi inhibeerivat toimet qPCR katsele.Malli kogust on parem uurida gradiendi järgi, nii et CT väärtus jääb vahemikku 20-30;

6. Määrake vajalik reaktsioonide arv, suurendage reaktsioonide arvu alusel 5-10% ja arvutage mahukonfiguratsiooni number;

7, süsteem valmistatakse eelsegu põhimõttel, segades pärast tsentrifuugimist ja tagades, et mullid ei tekiks;

8, Võimaluse korral valida tugitarvikud.

Seotud RT-qPCR komplekt