Avastamise spetsiifilisus
Enamikul juhtudel on praimeri disaini eesmärk PCR-i spetsiifilisuse maksimeerimine.Selle määrab paljude muutujate enam-vähem prognoositav mõju.Üks oluline muutuja on järjestus praimeri 3′otsas.
Oluline on see, et spetsiifilisuse jaoks kavandatud PCR-analüüsid säilitavad suurema tõenäosusega kõrge efektiivsuse laias dünaamilises vahemikus, kuna analüüs ei tooda mittespetsiifilisi amplifikatsiooniprodukte, konkureerides sellega PCR-reagentidega või inhibeerides peamist amplifikatsioonireaktsiooni.
Muidugi ei ole teatud juhtudel spetsiifilisus kõige olulisem, näiteks kui eesmärgiks on lähedalt seotud, kuid erinevate haigustekitajate kvantifitseerimine, on vaja spetsiaalseid disaini-, optimeerimis- ja verifitseerimisstandardeid.
Sulamiskõver on standardmeetod amplikonide spetsiifilisuse hindamiseks, vähemalt selles osas, kas amplifitseerida ühte sihtmärki.Siiski tuleb rõhutada, et sulamiskõverad võivad olla eksitavad, kuna näiteks võivad neid mõjutada suboptimaalsete praimerite ja madalate matriitsi kontsentratsioonide koosmõju.
P5 |Sulamiskõver näitab Tm nihkeid, mis on saadud kahe erineva koguse kahe sihtmärk-DNA tuvastamisel.
A. Kõrgematel kontsentratsioonidel (ad)) pärast qPCR-i mõõtmise lõpetamist ei ole nähtavat praimeri dimeeri.Kui malli kontsentratsioon väheneb 50 koopiani (e), hakkab ilmuma mittespetsiifiline toode ja sellest saab ainuke madalaima kontsentratsiooniga toode (f).
B. Test registreeris samad Tms-d kõigil sihtkontsentratsioonidel ja isegi madalaima kontsentratsiooni korral (5 koopiat) ei esinenud ilmset praimeri dimeeri.Nende kahe tuvastamismeetodi kasutamisel NTC-des amplifikatsiooniprodukte ei tuvastatud.
P5 näitab lahustumiskõveraid, mis on saadud proovidega, milles matriits esineb erinevates kontsentratsioonides.P 5a näitab, et kahe madalaima kontsentratsiooni korral on toodetud mittespetsiifiliste amplifikatsiooniproduktide Tms madalam kui spetsiifiliste amplikonide oma.
Ilmselgelt ei saa seda tuvastamismeetodit usaldusväärselt kasutada madala kontsentratsiooniga sihtmärkide tuvastamiseks.
Huvitaval kombel ei registreerinud NTC-d, st proovid, millel polnud üldse DNA-d, (mittespetsiifilisi) amplifikatsiooniprodukte, mis näitab, et taustgenoomne DNA võib osaleda mittespetsiifilises amplifikatsioonis/polümerisatsioonis.
Mõnikord ei saa selliseid taustapraimereid ja mittespetsiifilist amplifikatsiooni parandada, kuid sageli on võimalik välja töötada tuvastamismeetod, millel pole mittespetsiifilist amplifikatsiooni üheski matriitsi kontsentratsioonis ja NTC-s (P 5b).
Siin annab isegi sihtkontsentratsiooni amplifikatsiooni registreerimine Cq-ga 35 spetsiifilise lahustumiskõvera.Samamoodi ei näidanud NTC-d mittespetsiifilise amplifikatsiooni märke.Mõnikord võib tuvastamiskäitumine sõltuda emalahusest ja teatud puhverkompositsioonides tuvastatakse ainult mittespetsiifiline amplifikatsioon, mis võib olla seotud erinevate Mg2+ kontsentratsioonidega.
Avastamise stabiilsus
Ta optimeerimine on kasulik samm qPCR tuvastamise empiirilises kontrollimise ja optimeerimise protsessis.See annab otsese ülevaate praimerikomplekti vastupidavusest, näidates temperatuuri (või temperatuurivahemikku), mis annab madalaima Cq ilma NTC-d võimendamata.
Kahe- kuni neljakordne tundlikkuse erinevus ei pruugi kõrge mRNA ekspressiooniga inimeste jaoks olla oluline, kuid diagnostiliste testide puhul võib see tähendada erinevust positiivsete ja valenegatiivsete tulemuste vahel.
QPCR-i praimerite Ta-omadused võivad olla väga erinevad.Mõned testid ei ole väga robustsed ja kui neid ei tehta praimerite optimaalse Ta väärtuse all, kukuvad need kiiresti kokku.
See on oluline, kuna seda tüüpi tuvastamine on reaalses maailmas sageli problemaatiline ning proovi puhtus, DNA kontsentratsioon või muu DNA olemasolu ei pruugi olla optimaalne.
Lisaks võib sihtkoopiate arv varieeruda laias vahemikus ning reaktiivid, plastnõud või instrumendid võivad erineda testi seadistamisel kasutatavatest.
P6|Temperatuurigradient näitab PCR tuvastamise erinevat tugevust.
A. Kasutage Bioline'i Sensifast SYBR mastermixi (katalooginumber BIO-98050), et viia läbi inimese aju RNA-st valmistatud cDNA PCR.
B. Kasutage Bio-Radi CFX qPCR instrumenti, et salvestada apaleeni amplifikatsioonikaart ja lahustumiskõver (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. ACSBG1 amplifikatsioonigraafik ja sulamiskõver (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. GFAP amplifikatsioonigraafik ja lahustumiskõver (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Erinevatel lõõmutamistemperatuuridel registreeritud Cq-d, mis näitavad 7C temperatuurigradiendi all registreeritud Cq-de erinevust.
P 6 näitab tüüpilist ebasoovitava testi tulemust, kus qPCR viidi läbi, kasutades Tas gradienti vahemikus 59C kuni 67C (P 6a), kasutades kolme inimese ajuspetsiifilise geeni praimereid.
Amplifikatsioonigraafikult on näha, et Opalini praimerid pole kaugeltki ideaalsed, kuna nende optimaalne Ta vahemik on väga kitsas (joonis 6b), see tähendab, et Cq-d on laialt hajutatud, mille tulemuseks on Cq-d märkimisväärselt võrreldes nende optimaalse Cqs Low-ga.
See tuvastamismeetod on ebastabiilne ja võib viia suboptimaalse amplifikatsioonini.Seetõttu tuleks see praimerite paar ümber kujundada.Lisaks näitab sulamiskõvera analüüs (inset), et ka selle tuvastamismeetodi spetsiifilisus võib olla problemaatiline, kuna iga Ta sulamiskõver on erinev.
P 6c näidatud ACSBG1 tuvastusmeetod on tugevam kui ülaltoodud Opalini tuvastamise meetod, kuid see on endiselt ideaalsest kaugel ja on tõenäoline, et seda saab parandada.
Siiski rõhutame, et robustsuse ja spetsiifilisuse vahel pole vajalikku seost, kuna selle tuvastamismeetodi abil saadud lahustumiskõver näitab kõigis Tas (sisend) sama tippväärtust.
Teisest küljest on robustsuse test palju tolerantsem, tekitades sarnaseid Cq-sid paljudes Tas, nagu P 6d näidatud GFAP-testis.
Samas 8 kraadi Celsiuse vahemikus saadud Cq-de erinevus on väiksem kui 1 ja lahustumise kõver (sisend) kinnitab tuvastamisomadusi selles temperatuurivahemikus.Tasub teada, et arvutatud Tas ja tegelik Ta vahemik võivad olla väga erinevad.
On palju juhiseid, mis aitavad teadlastel kavandada tõhusaid praimereid, millest enamik põhinevad kauaaegsetel reeglitel ja palju tähelepanu on pööratud praimerite 3' otsale.Sageli soovitatakse lisada G või C 3' otsa ja kaks G või C alust (GC klamber), kuid mitte rohkem kui kaks viimasest 5 alusest.
Praktikas võivad need reeglid teadlasi juhendada, kuid need ei pruugi igal juhul õiged olla.
P7 |Praimeri 3′otsal on spetsiifilisusele või efektiivsusele vähe mõju.
A. Inimese HIF-1α (NM_181054.2) geeni praimerite asukoht.
B. Kasutage Agilent Brilliant III SYBR Greeni emalahust (kat. nr 600882), et amplifitseerida kuus katseainet.
C. Bio-Radi CFX qPCR seadme ja 3'-otsa praimerite abil registreeritud amplifikatsioonigraafik ja sulamiskõver.NTC-d on näidatud punaselt.
D. Cqs kirje iga katseüksuse kohta
Näiteks P 7 tulemus on vastuolus 3′otsa reegliga.Kõik kujundused annavad põhimõtteliselt samu tulemusi, ainult kahe praimeri kombinatsiooniga, mis viivad NTC mittespetsiifilise amplifikatsioonini.
Kuid me ei saa toetada GC klipi efekti, sest sel juhul ei vähenda A või T kasutamine maksimaalselt 30 alusena spetsiifilisust.
Test C, kus F-praimer lõpeb GGCC-ga, registreeris Cq-d NTC-des, mis näitab, et võiks soovida neid järjestusi vältida 30-otsas.Rõhutame, et ainus viis praimeripaari parima 3'-otsa järjestuse määramiseks on mõne kandidaatpraimeri eksperimentaalne hindamine.
Võimendi efektiivsus
Oluline on see, et kuigi mittespetsiifiline PCR tuvastamine ei saa kunagi muutuda spetsiifiliseks, saab amplifikatsiooni efektiivsust reguleerida ja maksimeerida mitmel erineval viisil, muutes ensüümi, emalahust, lisaaineid ja tsüklitingimusi.
PCR tuvastamise efektiivsuse hindamiseks on kõige parem kasutada 10- või 5-kordset sihtnukleiinhappe seerialahjendust, st "standardkõvera meetodit".
Kui standardkõvera loomiseks kasutatakse PCR amplikoneid või sünteetilisi DNA sihtmärke, tuleb nende sihtmärkide seerialahjendusi segada konstantse koguse taust-DNA-ga (näiteks genoomse DNA-ga).
P8 |Lahjenduskõver PCR efektiivsuse hindamiseks.
A. Kasutage HIF-1 jaoks praimereid: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ja R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ja Agilenti Brilliant III SYBR Green mastermixi (katalooginumber 600882) PCR ja sulamiskõvera tingimuste jaoks.
B. 100 ng RNA-d pöördtranskribeeriti, lahjendati 2 korda ja seeriaviisiliselt lahjendatud cDNA proove lahjendati 5 korda 1 ng inimese genoomse DNA-ga.Sulamiskõver on näidatud sisetükis.
C. RT reaktsiooni, lahjendamist ja seerialahjendust korrati teise cDNA proovi jaoks ning tulemused olid sarnased.
P 8 näitab kahte standardkõverat, kasutades sama tuvastamismeetodit kahel erineval cDNA proovil, tulemuseks on sama efektiivsus, umbes 100%, ja ka R2 väärtus on sarnane, st katseandmete ja regressioonijoone või andmete sobivusaste lineaarsusaste.
Kaks standardkõverat on võrreldavad, kuid mitte täpselt samad.Kui eesmärk on sihtmärk täpselt kvantifitseerida, tuleb märkida, et koopiate arvu arvutamine ilma ebakindlust selgitamata on vastuvõetamatu.
P9 |Standardkõvera abil kvantifitseerimisega seotud mõõtemääramatus.
A. Kasutage PCR ja sulamiskõvera tingimuste teostamiseks GAPDH (NM_002046) praimereid.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ja R: TAACTGGTTGAGCACAGG ja Bioline'i Sensifast SYBR mastermix (katalooginumber BIO-98050).
B. Bio-Radi CFX qPCR instrumendiga salvestatud amplifikatsioonitabel, sulamiskõver ja standardkõver.
C. Standardkõvera graafik ja 95% usaldusvahemik (CI).
D. Lahjenduskõveralt tuletatud kolme Cq väärtuse koopiate arv ja 95% usaldusvahemik.
P 9 näitab, et optimeeritud testi puhul on ühe standardkõvera olemuslik varieeruvus ligikaudu 2 korda suurem (95% usaldusvahemik, miinimum kuni maksimum), mis võib olla väikseim varieeruvus, mida võib oodata.
Seotud toode:
Mouse Tail Direct PCR komplekt
Animal Tissue Direct PCR komplekt
Postitusaeg: 30. september 2021
