Reaalajas PCR, tuntud ka kui kvantitatiivne PCR või qPCR, on meetod PCR amplifikatsiooniproduktide reaalajas jälgimiseks ja analüüsimiseks.
Kuna kvantitatiivse PCR-i eelisteks on lihtne toimimine, kiire ja mugav, kõrge tundlikkus, hea korratavus ja madal saastumise määr, kasutatakse seda laialdaselt meditsiinilistes testides, ravimite efektiivsuse hindamises, geeniekspressiooni uuringutes, transgeensetes uuringutes, geenide tuvastamisel, patogeenide tuvastamisel, loomade ja taimede tuvastamisel., toidu testimine ja muud valdkonnad.
Seega, olenemata sellest, kas tegelete bioteaduste alusuuringutega või farmaatsiaettevõtete, loomakasvatusettevõtete, toiduettevõtete töötajad või isegi sisenemis-väljapääsu kontrolli- ja karantiinibüroode, keskkonnaseire osakondade, haiglate ja muude üksuste töötajad, puutute teid rohkem või vähem kokku või peate teadma kvantitatiivse PCR valdamise teadmisi.

Reaalajas PCR põhimõte

Real Time PCR on meetod, mille käigus lisatakse PCR reaktsioonisüsteemi fluorestseeruvad ained ning fluorestsentssignaali intensiivsust PCR reaktsiooni protsessis jälgitakse reaalajas kvantitatiivse PCR instrumendiga ning lõpuks analüüsitakse ja töödeldakse katseandmeid.

【Amplifikatsioonikõver】on kõver, mis kirjeldab PCR dünaamilist protsessi.PCR amplifikatsioonikõver ei ole tegelikult standardne eksponentsiaalkõver, vaid sigmoidne kõver.

[võimenduskõvera platvormi faas]PCR-i tsüklite arvu suurenemise, DNA polümeraasi inaktiveerimise, dNTP-de ja praimerite ammendumise ning sünteesireaktsiooni inhibeerimisega reaktsiooni kõrvalprodukti pürofosfaadiga jne ei laiene PCR alati eksponentsiaalselt.ja jõuab lõpuks platoole.

[Amplifikatsioonikõvera eksponentsiaalne kasvupiirkond]Kuigi platoofaas on väga erinev, on amplifikatsioonikõvera eksponentsiaalse kasvu piirkonna teatud piirkonnas korratavus väga hea, mis on PCR kvantitatiivse analüüsi jaoks väga oluline.

[Läviväärtus ja Ct väärtus]Fluorestsentsi tuvastamise piirväärtuse määrasime amplifikatsioonikõvera eksponentsiaalse kasvupiirkonna sobivasse kohta, nimelt läviväärtuse (Threshold).Läviväärtuse ja võimenduskõvera ristumiskoht on Ct väärtus, see tähendab, et Ct väärtus viitab tsüklite arvule (Threshold Cycle), kui läviväärtus on saavutatud.

Allolev graafik näitab selgelt lävejoone ja võimenduskõvera, läve ja Ct väärtuse vahelist seost.

【Kuidas kvantifitseerida?】

Matemaatiline teooria on tõestanud, et Ct väärtusel on pöördvõrdeline lineaarne seos algmallide arvu logaritmiga.Reaalajas PCR jälgib PCR amplifikatsiooniprodukte reaalajas ja kvantifitseerib need eksponentsiaalse võimenduse faasis.

Iga PCR tsükli puhul suurenes DNA eksponentsiaalselt 2 korda ja jõudis peagi platoole.

Eeldusel, et lähte-DNA kogus on A₀ , pärast n tsüklit saab DNA produkti teoreetilise koguse väljendada järgmiselt:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Mida suurem on DNA esialgne kogus A 0, seda varem jõuab amplifitseeritud produkti kogus tuvastamisväärtuseni An ja tsüklite arv An jõudmisel on Ct väärtus.See tähendab, et mida suurem on algne DNA kogus A 0, seda varem saavutab amplifikatsioonikõvera tipud ja vastavalt sellele on vajalik tsüklite arv n väiksem.

Me teostame teadaoleva kontsentratsiooni standardi gradientlahjenduse ja kasutame seda reaalajas PCR-i mallina ning võrdsete ajavahemike järel saadakse amplifikatsioonikõverate seeria järjestuses, kus DNA kogus algab suuremast väiksemani.Vastavalt lineaarsele seosele Ct väärtuse ja algusmallide arvu logaritmi vahel, a[standardkõvera] saab luua .

Asendades tundmatu kontsentratsiooniga proovi Ct väärtuse standardkõveraga, võib saada teadmata kontsentratsiooniga proovi esialgse matriitsi koguse, mis on reaalaja PCR kvantitatiivne põhimõte.

Reaalaja PCR tuvastamise meetod

Reaalajas PCR tuvastab PCR amplifikatsiooniproduktid, tuvastades reaktsioonisüsteemis fluorestsentsi intensiivsuse.

Fluorestsentsvärvi manustamismeetodi põhimõte】

Fluorestseeruvad värvained, nagu TB Green®, võib mittespetsiifiliselt seonduda kaheahelalise DNA-ga PCR-süsteemides ja seondumisel fluorestseeruda.

Fluorestsentsi intensiivsus reaktsioonisüsteemis suurenes PCR tsüklite suurenemisega eksponentsiaalselt.Fluorestsentsi intensiivsust tuvastades saab reaalajas jälgida DNA amplifikatsiooni kogust reaktsioonisüsteemis ning seejärel saab pöördvõrdeliselt hinnata lähtematriitsi kogust proovis.

【Fluorestseeruva sondi meetodi põhimõte】

fluorestsentssondon nukleiinhappejärjestus, mille 5'-otsas on fluorestseeruv rühm ja 3'-otsas on kustutav rühm, mis võib spetsiifiliselt matriitsiga seonduda.Kui sond on terve, summutab fluorofoori poolt kiiratud fluorestsentsi kustutav rühm ja see ei saa fluorestseeruda.Kui sond laguneb, fluorestseeruv aine dissotsieerub ja kiirgab fluorestsentsi.

PCR reaktsioonilahusele lisatakse fluorestsentssond.Lõõmutamisprotsessi ajal seostub fluorestseeruv sond malli konkreetse positsiooniga.Laiendusprotsessi käigus võib PCR ensüümi 5'→3' eksonukleaasi aktiivsus lagundada matriitsiga hübridiseerunud fluorestseeruva sondi ja fluorestseeruv aine dissotsieerub fluorestsentsi kiirgamiseks.Sondi fluorestsentsi intensiivsuse tuvastamisega reaktsioonisüsteemis on võimalik saavutada PCR-produkti amplifikatsioonikoguse jälgimise eesmärk.

【Fluorestsentsi tuvastamise meetodi valik】

Kui seda kasutatakse suure homoloogiaga järjestuste eristamiseks ja mitmekordse PCR tuvastamiseks, näiteks SNP tüpiseerimise analüüsiks, on fluorestsentssondi meetod asendamatu.
Teiste reaalajas PCR-katsete jaoks saab kasutada lihtsat, lihtsat ja odavat fluorestseeruva kimääri meetodit.

sondidTugeva spetsiifilisusega, võimeline mitmekordseks PCR-iks

Puudujääk

Kõrged spetsiifilisuse nõuded võimendusele;

multipleks-PCR-i ei saa teha Vajadus kavandada spetsiifilised sondid, kõrge hind;

mõnikord on sondi projekteerimine keeruline

Seotud tooted: