RNase on tundlik sõna, mida paljud õpilased, kes sageli RNA ekstraheerimise katseid teevad, kuulda ei taha.Täielikult relvastatud RNA, mis lõpuks ekstraheeriti väga toksiliste reagentidega fenooli ja kloroformiga, lagunes.Ma ei ole leppinud!!!Täna heidame pilgu kuulsa Rnase päritolule.

Ribonukleaas (RNaas) või RNaas on nukleaas, mis suudab RNA hüdrolüüsida väikesteks molekulideks.RNaas kui väikese molekuliga valk on ebatavaliselt stabiilne .Tavaline kõrge temperatuuri ja kõrgsurve auruga steriliseerimine ja valgu inhibiitorid ei suuda seda täielikult inaktiveerida.RNaasi stabiilsus tuleneb peamiselt disulfiidsidemetest struktuuris.Näiteks veise pankrease tavaliselt kasutataval RNaasil on ainult 124 aminohapet, kuid see sisaldab 4 disulfiidsidet.Väävelside ja disulfiidside annavad RNaasile suurepärase termilise stabiilsuse.Lisaks on rnaas suhteliselt väikese molekulmassiga ja suudab paljudel juhtudel kiiresti taastada oma esialgse konformatsiooni.

Lisaks sellele, et see on äärmiselt stabiilne,RNaasid on laboris üldlevinud .RNaas on bioloogiline kaitsemehhanism.Raku jaoks on eksogeenne RNA sageli surmav.Võrreldes eksogeense DNA-ga on eksogeenne RNA sageli ohtlikum.RNA-d transkribeeritakse ja transleeritakse õnnelikult, nii et peaaegu kõik organismid on välja töötanud RNaasid, et kaitsta end eksogeense RNA sissetungi eest.Seetõttu eritavad laboris kultiveeritud bakterirakud ja teie, kes RNA-d ekstraheerite, RNaasi aroomi.Inimese kehavedelikud (sülg, pisarad jne) sisaldavad suures koguses RNaasi, seega ärge nutke, kui RNA laguneb.Mida rohkem sa nutad, seda hullem on RNA lagunemine!!Õde Daiyu ei sobi RNA ekstraheerimiseks!

Lisaks sisaldab teie õrn nahk ka palju RNaasi ning RNaasi sisaldavad ka nahaga puudutatud markerid, pipetid, külmiku uksed ja ukselingid.

Kui palju on segadust, vaatame, kuidas RNaasidega toime tulla.

Esimene asi, millele kõik RNA eemaldamisel mõtlevad, onDEPC(dietüülpürokarbonaat).DEPC denatureerib peamiselt valku, ühinedes RNaasi aktiivse rühma histidiini imidasoolitsükliga, inhibeerides seeläbi ensüümi aktiivsust.0,1% DEPC võib Rnase-le paremini eemaldada, kuid me peame tähelepanu pöörama sellele, et DEPC on tuntud kantserogeen, mistõttu tuleks selle kasutamisel olla erilist tähelepanu.

RNaasi puhul peame alustama kahest aspektist,esimene on endogeense RNaasi aktiivsuse pärssimine

Tavalised RNA ekstraheerimisreagendid, nagu guanidiini isotiotsüanaat ja DTT, mis sisalduvad Trizolis, võivad avada RNaasi disulfiidsideme, kuid mõned RNaasid on siiski olemas, eriti koeproovides, seega pöörake tähelepanu madalale temperatuurile.

1.Kastke koeproov kohe pärast väljavõtmist vedelasse lämmastikusse või kaubanduslikku RNA säilituslahusesse.

2.Pärast rakuproovi RNA ekstraheerimist lisage see lüüsilahusele ja lüüsige jääkastil

3. Lihvimiseks on kõige parem kasutada vedelat lämmastikku kui koeproovid homogeniseeritakse.Kui kasutate elektrilist homogenisaatorit ilma vedela lämmastikuta, pöörake tähelepanu homogenaadi adapteri täielikule eeljahutamisele.

Teine on eksogeenne DNaas

1.Olge täielikult relvastatud, kandke laborikitlit, kandke maski ja kandke kindlasti paari uusi kindaid (ärge olge nii kokkuhoidlikud!! Tuleb märkida, et Trizol on ülimalt söövitav ja see on ka läbi kinnaste väga tugev, nii et ärge tilguge kätele).

2.Kõik kasutatud pipetiotsad, EP-tuubid, PCR-tuubid ja muud seadmed tuleb de-RNaasiga töödelda.Seda saab leotada 0,1% DEPC-s ja seejärel survestada kõrge rõhu all.Pöörake tähelepanu tõmbekapis kasutamisele.Kohalikud türannid saavad ensüümide eemaldamiseks tarvikuid otse osta.

PS: Lubage mul öelda teile üks laisk meetod.Kuigi kõrge temperatuur ja kõrge rõhk ei suuda RNaasi täielikult eemaldada, eemaldab see suure osa sellest.2 korda kõrgel temperatuuril ja kõrgel rõhul on hea mõju ning RNA ekstraheerimisel on vähe mõju.

3.Alkohol võib denatureerida valke,nii et RNA ekstraheerimise tabelit saab pühkida 75% alkoholiga , ja kindaid võib ka alkoholiga piserdada.

4.Lõplikku RNA-d lahustavat lahust ja tsentrifuugitoru tuleks samuti deRNaasiga töödelda.DEPC vesi on tavaliselt kasutatav RNA-d lahustav lahus.Räägime DEPC vee õigest valmistamismeetodist (pidage meeles, et kaubanduslik DEPC tuleb selle ostmisel ümber pakkida)

Lisage DEPC ülipuhtale veele vahekorras 1:1000, loksutage korralikult, laske üleöö 37 °C juures seista ja steriliseerige 121 °C juures kõrgel temperatuuril ja kõrgel rõhul 15 minutit.DEPC vett võib säilitada temperatuuril -20°C 1 ml alikvootidena.

Kokkuvõtteks: madal temperatuur on võti, kulumaterjale käsitletakse hästi, täielikult relvastatud ja vähem juttu!

See on tänase strateegia jaoks kõik.Soovin teile kogu mainitud RNA kontsentratsiooni ja puhtust.Mõlemad A260/A280 on 2.0!!!

Muidugi, kui kasutate atoatemperatuuril töötav RNA ekstraheerimiskomplekt, ei pruugi teil ülaltoodud probleeme tekkida.

Toatemperatuuril töötamine ilma DNaasi lisamata eraldab rakkudest kogu RNA 11 minutiga ja kogu RNA loomsetest kudedest või taimedest 30 minutiga.

Proovinäidiste saamiseks võtke ühendust:overseas@foregene.com

Seotud tooted:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/