Traditsioonilised pöördtranskriptaasid ei talu kõrgeid temperatuure (MMLV aktiivsuse optimaalne temperatuur on 37–50 °C ja AMV on 42–60 °C).Keerulisemat viiruse RNA-d ei saa madalatel temperatuuridel tõhusalt cDNA-ks pöördtranskribeerida, mille tulemuseks on tuvastamise tõhusus.Traditsiooniline RT-qPCR nõuab üldjuhul kahe võtmeensüümi (pöördtranskriptaas ja DNA polümeraas) osalemist, mis muudab reaktsioonisüsteemi toimimise lihtsustamise ja kulude vähendamise võimatuks.Siin tutvustame kahte kõrge temperatuuri suhtes vastupidavat pöördtranskriptaasi, TtH ja RevTaq.Neil kahel ensüümil on ka DNA polümeraasi funktsioon, mistõttu neid nimetatakse bifunktsionaalseteks ensüümideks.

TtH DNA polümeraas

Olete kindlasti kuulnud TtH-st, mis on tuletatud termofiilsest bakterist Thermus thermophilus HB8.Kahevalentsete katioonide, nagu Mg2+, juuresolekul on sellel DNA polümeraasi aktiivsus.Seda kasutatakse laialdaselt PCR-reaktsioonides nagu Taq ensüüm, kuid sellel on kõrgem kuumakindlus kui Taq ensüümil, seega on sellel parem mõju ka kõrge GC-sisaldusega mallidega PCR-ile.

· Sellel ensüümil puudub põhimõtteliselt 3′→5′ eksonukleaasi aktiivsus ja 5′→3′ eksonukleaasi aktiivsus, seega saab seda kasutada ka dideoksüsekveneerimiseks.

· Sellel ensüümil on RTaasi aktiivsus.Mn2+ juuresolekul suureneb RTaasi aktiivsus.Seda funktsiooni kasutades saab seda kasutada pöördtranskriptsioonireaktsiooni ja PCR reaktsiooni läbiviimiseks samas katseklaasis, st üheastmelise RT-PCR-i läbiviimiseks.Kuid Mn2+ juuresolekul ei ole RT-PCR täpsus kõrge.RT aktiivsusel pole rnaasi H aktiivsusega midagi pistmist.

· Tth-DNA polümeraasi aktiivsuse suurenemine (pH9, optimaalne +55℃～+70℃, maksimaalne +95℃) ületab RNA sekundaarstruktuuri põhjustatud probleemid.Saadud cDNA-d saab amplifitseerida PCR-ga sama ensüümiga Mg2+ ioonide juuresolekul.

· Tth-DNA polümeraasi võime teostada kõrgetel temperatuuridel pöördtranskriptsiooni ja DNA amplifikatsiooni muudab selle ensüümi kasulikuks raku- ja viirus-RNA kvantitatiivses RT-PCR, kloonimise ja geeniekspressiooni analüüsis.
· Tth-DNA polümeraasi kasutatakse RT-PCR jaoks RNA amplifitseerimiseks kuni 1 kb.

Omadused ja eelised

Tth DNA polümeraas:

• Tagada polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) toote suurus, vähemalt 1000 aluspaari RT-PCR reaktsioonis

• Aktsepteerige substraadina modifitseeritud desoksüribonukleosiidtrifosfaati

• Pole seotud RNaasi H aktiivsusega

• Sellel on kõrge termiline stabiilsus, et ületada probleeme, mis on tavaliselt seotud RNA kõrge sekundaarstruktuuriga

RevTaq RT-PCR DNA polümeraas

Kuumakindel DNA polümeraas, millel on pöördtranskriptaasi aktiivsus

RevTaq-RT-PCR-DNA polümeraas on konstrueeritud, väga kuumakindel, kahefunktsiooniline ensüüm, millel on pöördtranskriptaasi ja DNA polümeraasi aktiivsus, mis on saadud suunatud ja kunstliku evolutsiooni teel.

· RevTaq RT-PCR DNA polümeraasi poolväärtusaeg 95°C juures on pikem kui 40 minutit.

· RevTaq RT-PCR DNA polümeraas võimaldab kõrgel temperatuuril pöördtranskriptsiooni otse RNA matriitsist ja pöördtranskriptsiooni etappi saab korrata mitu korda, et genereerida rohkem cDNA malle.

· RevTaq RT-PCR DNA polümeraas võimaldab "null-astmelist" RT-PCR-i (pole isotermilise pöördtranskriptsiooni etappi), sest tsüklilises PCR pikendamise etapis toimuvad pöördtranskriptsioon ja DNA amplifikatsioon samaaegselt.See soodustab ka pöördtranskriptsiooni reaktsiooni kõrgetel temperatuuridel, minimeerides sellega probleeme, mis tekivad RNA tugeva sekundaarstruktuuri sulatamisel kõrgel temperatuuril.

· Tänu aptameeripõhisele kuumkäivitusvalemile annab RevTaq RT-PCR DNA polümeraas paremaid tulemusi, kui anniilimis- ja pikendamistemperatuur on kõrgem kui 57°C.

· Kuna ensüüm on kuumakindel, on soovitatav kujundada väga kõrge sulamistemperatuuriga (>60°C) praimerid ja sondid.

· Soovitatav on optimeerida lõõmutamise/pikendusetapi temperatuuri reaktsiooni seadistamise protsessi käigus temperatuurigradienti abil.

· Mida kõrgem on temperatuur, seda suurem on PCR spetsiifilisus.Pöördtranskriptsioonitsükkel viiakse tavaliselt läbi kõrgemal temperatuuril kui PCR tsükkel, kuna DNA praimer:RNA matriitsi hübridisatsioonil on tavaliselt kõrgem sulamistemperatuur kui DNA praimer:cDNA matriitsi dupleks.

· RevTaq RT-PCR DNA polümeraas on geneetiliselt muundatud ja optimeeritud ning amplikoni suurus on vahemikus 60-300 aluspaari.

RevTaq RT-PCR DNA polümeraasi tuvastamise piir ulatub 4 koopiani/

Optimeeritud reaktsioonisüsteem (kõrge sulamistemperatuuriga praimerite loomine) on näidatud joonisel.RevTaq RT-PCR DNA polümeraasi juhitav RT-PCR näitab paremat tundlikkust kui TaqPathi 1-astmeline RT-qPCR põhisegu ja madalam tuvastatavus proovi lahjendusgradient.

Veel eeliseid:

Kiirkäivitusfunktsioon → Algse termilise denatureerimise etapi võib vahele jätta.

Kuumkäivitusega aptameeri valem → Tagage koheselt 100% ensüümi aktiivsus ja vältige mittespetsiifilist amplifikatsiooni madalatel temperatuuridel (<57°C).

Lõhustamisfunktsioon → RNA ekstraheerimise etapp jäetakse välja, kuna RevTaq RT-PCR DNA polümeraas suudab töödelda ka toorreaktsiooni proove.See võib kuumas RT-PCR tsüklis koheselt hävitada eukarüootide, bakterite ja viiruste rakumembraanid.

IVD tooraine tase → kõrged kvaliteedistandardid ja äärmiselt konkurentsivõimelised hinnad