Näpunäiteid liimi taastumise parandamiseks

1. Suurendage elektroforeesi ajal proovi koormust.

2. Kasutage värskelt valmistatud elektroforeesipuhvrit.

3. Liimi lõikamisel proovige lõigata ainult liimi ribadega, et vähendada liimilõikamise mahtu: ärge vajage väheste otstarvetega liimi, vastasel juhul mõjutab see taastumiskiirust.

4. Pärast kahe või enama liimitüki sulatamist kasutage toru, olenemata selle mahust, ja kandke see samasse kolonni.

5. Sooli lisatud lahust võib olla veidi rohkem, mis soodustab DNA sidumist membraaniga, kuid üldjuhul ei ületa 750ul.

6. Geeli taastumise võti on DNA sidumine kolonniga kolonnis oleva lahuse soola kontsentratsiooni, happesuse (laengu) ja hüdrofoobsuse kaudu.Seega, kui elektroforeesipuhvri pH on liiga kõrge, võib soolile lisada 10 ul (pH 5,0, 3 mol/L NaAC);selleks, et DNA molekule membraanil paremini kinni püüda, võib pärast liimi lahustamist vedelikku lisada kuumutamiseks 30% isopropanooli.

7. Enne eluendi lisamist jätke kolonn mõneks minutiks (umbes 10 minutiks) toatemperatuurile, et etanool täielikult aurustuks.

8. Lõpuks lisage regenereerimismahu minimeerimiseks vähem eluenti.Üldjuhul kasutatakse elueerimiseks 30-50μl eluenti (mitte liiga vähe, muidu ei suuda see membraani märjaks teha, mis ei soodusta elueerimist);elueerimispiisad on membraani keskel, et elueerida täielikult membraaniga seotud DNA.

9. Peale eluendi lisamist võib seda 55-kraadises veevannis 5 minutiks elueerida või üle 10 minutiks 50kraadisesse veevanni panna või ööseks 4 kraadisega parakilega kinni keerata ja siis järgmisel päeval taaskasutamiseks tsentrifuugida, mõju on hea.

10. Lisage tsentrifuugitud eluaat tagasi adsorptsioonikolonni ja tsentrifuugige uuesti.

Üksikasjalikud meetodid ja protseduurid PCR-produktide taastamiseks

1. Tavaline kummi taaskasutus

Kui soovite liimi taastada, on kõige parem kasutada komplekti, mis on mugav ja millel on veidi suurem taastumismäär.Kui teil on tõesti vaja see käsitsi taastada, saate pärast liimi lõikamist lisada TE-d 3 korda rohkem.Pärast veevannis sulatamist ekstraheeritakse fenool, fenool/kloroform puhtalt ja etanool sadestatakse.See on kõik.

2. DNA taastamine madala sulamistemperatuuriga geelidest

DNA fragmentide puhastamine Lisage TE-d (10 mmol/l Tris-HCl pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA), mis vastab geeli mahule ja asetage 5 minutiks 65 °C veevanni, et geel täielikult lahustuks.

Pärast toatemperatuurini viimist lisati võrdne kogus fenooli (küllastunud TE-ga, TE suleti ülemisse kihti ja alumine fenoolikiht eemaldati) ning segu segati õrnalt (segamine pole vajalik) ja tsentrifuugiti kiirusel 12 000 p/min 3 minutit.Korda 1-2 korda.

Võtke supernatant, lisage etanooli sadestamiseks 0,1 mahuosa 3 mol/l naatriumatsetaati (pH 5,2) ja 2,5 korda absoluutset etanooli.Lahustage puhastatud DNA sobiva koguse TE-ga, mõõtke selle sisaldus ja valmistage ette kasutamiseks (seda saab kasutada sihtgeeni struktuuri analüüsiks, sondi ettevalmistamiseks jne).

3. PCR taastamine hea amplifikatsioonispetsiifilisusega

Kui PCR-i amplifikatsiooni spetsiifilisus on hea, on see lihtsalt PCR-produkti puhastamine ja taastamine.Võite lisada PCR tootele 50 ug/ml proteinaas K, 37 kraadi 1 tund, ekstraheerida üks kord fenooli/kloroformiga, ekstraheerida üks kord kloroformiga ja lisada 0,1 mahuosa supernatanti.Naatriumatsetaat eraldati sadestamisel 2,5 mahu absoluutse etanooliga.

Seotud tooted:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/