1. Algteadmised (kui soovite näha eksperimentaalset osa, kandke üle otse teise osasse)
Tavapärase PCR tuletisreaktsioonina jälgib reaalajas PCR peamiselt amplifikatsiooniprodukti koguse muutumist PCR amplifikatsioonireaktsiooni igas tsüklis reaalajas fluorestsentssignaali muutumise kaudu ja analüüsib kvantitatiivselt lähtemalli ct väärtuse ja standardkõvera vahelise seose kaudu.
RT-PCR spetsiifilised andmed onbaasjoon, fluorestsentsi lävijaCt väärtus.
| baasjoon: | 3.-15. tsükli fluorestsentsi väärtus on baasjoon (baasline), mis on tingitud mõõtmise aeg-ajalt esinevast veast. |
| Lävi (lävi): | Viitab fluorestsentsi tuvastamise piirile, mis on seatud sobivasse kohta amplifikatsioonikõvera eksponentsiaalse kasvu piirkonnas, mis on tavaliselt 10-kordne baasjoone standardhälve. |
| CT väärtus: | See on PCR-tsüklite arv, mil fluorestsentsi väärtus igas reaktsioonitorus jõuab läviväärtuseni. Ct väärtus on pöördvõrdeline esialgse malli kogusega. |
Tavalised märgistamismeetodid RT-PCR jaoks:
| meetod | eelis | puudujääk | kohaldamisala |
| SYBR RohelineⅠ | Lai kasutusala, tundlik, odav ja mugav | Praimeri nõuded on kõrged, kalduvad mittespetsiifiliste ribade tekkele | See sobib erinevate sihtgeenide kvantitatiivseks analüüsiks, geeniekspressiooni uurimiseks ning transgeensete rekombinantsete loomade ja taimede uurimiseks. |
| TaqMan | Hea spetsiifilisus ja kõrge korratavus | Hind on kõrge ja sobib ainult konkreetsete eesmärkide saavutamiseks. | Patogeenide tuvastamine, ravimiresistentsuse geeniuuringud, ravimite efektiivsuse hindamine, geneetiliste haiguste diagnoosimine. |
| molekulaarne majakas | Kõrge spetsiifilisus, fluorestsents, madal taust | Hind on kõrge, see sobib ainult konkreetseks otstarbeks, disain on keeruline ja hind on kõrge. | Spetsiifiline geenianalüüs, SNP analüüs |
2. Eksperimentaalsed sammud
2.1 Eksperimentaalsest rühmitusest- rühmas peab olema mitu kaevu ja bioloogilisi kordusi.
| ① | Tühi kontroll | Kasutatakse rakkude kasvu oleku tuvastamiseks katsetes |
| ② | Negatiivne kontroll-siRNA (mittespetsiifiline siRNA järjestus) | Näidake RNAi tegevuse spetsiifilisust.siRNA võib indutseerida mittespetsiifilist stressireaktsiooni kontsentratsioonil 200 nM. |
| ③ | Transfektsioonireaktiivi kontroll | Välistada transfektsioonireagendi toksilisus rakkudele või mõju sihtgeeni ekspressioonile |
| ④ | siRNA sihtgeeni vastu | Lõpetage sihtgeeni ekspressioon |
| ⑤ (valikuline) | positiivne siRNA | Kasutatakse katsesüsteemi ja tööprobleemide tõrkeotsinguks |
| ⑥ (valikuline) | Fluorestseeruv kontroll-siRNA | Rakkude transfektsiooni efektiivsust saab jälgida mikroskoobiga |
2.2 Krundi kujundamise põhimõtted
| Võimendatud fragmendi suurus | Eelistatavalt 100-150 bp |
| Praimeri pikkus | 18-25 bp |
| GC sisu | 30–70%, eelistatavalt 45–55% |
| Tm väärtus | 58-60 ℃ |
| Järjestus | Vältige T/C pidevat;A/G pidev |
| 3 lõpu jada | Vältige GC-rikkaid või AT-rikkaid;terminali alus on eelistatavalt G või C;kõige parem on vältida T |
| Vastastikune täiendavus | Vältige rohkem kui 3-aluselisi komplementaarseid järjestusi praimeris või kahe praimeri vahel |
| Spetsiifilisus | Kasutage praimeri spetsiifilisuse kinnitamiseks kiirotsingut |
①SiRNA on liigispetsiifiline ja erinevate liikide järjestused on erinevad.
②SiRNA on pakendatud külmkuivatatud pulbrisse, mida saab toatemperatuuril stabiilselt säilitada 2-4 nädalat.
2.3 Tööriistad või reaktiivid, mis tuleb eelnevalt ette valmistada
| Praimer (sisemine viide) | Kaasa arvatud kaks edasi- ja tagasikäiku |
| Praimerid (sihtgeen) | Kaasa arvatud kaks edasi- ja tagasikäiku |
| Sihtmärk Si RNA (3 riba) | Üldiselt sünteesib ettevõte 3 riba ja seejärel valib RT-PCR abil ühe neist kolmest. |
| Transfektsiooni komplekt | Lipo2000 jne. |
| RNA kiire ekstraheerimise komplekt | RNA ekstraheerimiseks pärast transfektsiooni |
| Kiire pöördtranskriptsiooni komplekt | cDNA sünteesi jaoks |
| PCR amplifikatsioonikomplekt | 2×Super SYBR roheline qPCR Master Mix |
2.4 Seoses probleemidega, millele tuleb konkreetsetes katseetappides tähelepanu pöörata:
①siRNA transfektsiooniprotsess
1. Plaatimiseks võite valida 24 süvendiga plaadi, 12 süvendiga plaadi või 6 süvendiga plaadi (24-süvendilise plaadi igas süvendis pakutav keskmine RNA kontsentratsioon on umbes 100-300 ng/uL) ja rakkude optimaalne transfektsioonitihedus on kuni 60–80% või nii.
2. Transfektsiooni etapid ja erinõuded on rangelt kooskõlas juhistega.
3. Pärast transfektsiooni saab proove koguda 24–72 tunni jooksul mRNA tuvastamiseks (RT-PCR) või valgu tuvastamiseks 48–96 tunni jooksul (WB).
② RNA ekstraheerimisprotsess
1. Vältige saastumist eksogeensete ensüümidega.See hõlmab peamiselt maskide ja kinnaste ranget kandmist;kasutades steriliseeritud pipetiotsikuid ja EP torusid;katses kasutatav vesi peab olema RNaasivaba.
2. Soovitatav on teha kaks korda kiirtõmmise komplektis soovitatut, mis parandab tõesti puhtust ja saagist.
3. Jääkvedelik ei tohi puudutada RNA kolonni.
③ RNA kvantifitseerimine
Pärast RNA ekstraheerimist saab selle kvantifitseerida otse Nanodropi abil ja minimaalne näit võib olla nii madal kui 10 ng/ul.
④ Pöördtranskriptsiooni protsess
1. RT-qPCR kõrge tundlikkuse tõttu tuleks iga proovi jaoks teha vähemalt 3 paralleelset süvendit, et vältida seda, et järgnev Ct oleks liiga erinev või SD ei oleks statistilise analüüsi jaoks liiga suur.
2. Ärge külmutage ega sulatage Master mix korduvalt.
3. Iga toru/auk tuleb asendada uue otsaga!Ärge kasutage proovide lisamiseks pidevalt sama pipetiotsikut!
4. Pärast proovi lisamist 96 süvendiga plaadile kinnitatud kile tuleb plaadiga siluda.Enne masinale panemist on kõige parem tsentrifuugida, et toru seinal olev vedelik saaks alla voolata ja õhumullid eemaldada.
⑤Üldine kõvera analüüs
| Logaritmilise kasvu periood puudub | Võimalik, et malli kõrge kontsentratsioon |
| CT väärtus puudub | Valed sammud fluorestsentssignaalide tuvastamiseks; praimerite või sondide lagunemine – selle terviklikkust saab tuvastada PAGE elektroforeesiga; ebapiisav kogus malli; mallide lagunemine – lisandite sissetoomise ning korduva külmutamise ja sulatamise vältimine proovi ettevalmistamisel; |
| Ct>38 | Madal võimenduse efektiivsus;PCR toode on liiga pikk;lagunevad erinevad reaktsioonikomponendid |
| Lineaarne võimenduskõver | Sondid võivad korduvate külmutamis-sulatamise tsüklite või pikaajalise valgusega kokkupuute tõttu osaliselt laguneda |
| Erinevus topeltaukudes on eriti suur | Reaktsioonilahus ei ole täielikult sulanud või reaktsioonilahus ei ole segunenud;PCR-seadme termiline vann on saastunud fluorestseeruvate ainetega |
2.5 Andmeanalüüsist
qPCR-i andmete analüüsi võib jagada suhteliseks kvantifitseerimiseks ja absoluutseks kvantifitseerimiseks.Näiteks ravirühma rakud võrreldes kontrollrühma rakkudega,
Kui mitu korda X-geeni mRNA muutub, on see suhteline kvantifitseerimine;teatud arvus rakkudes X geeni mRNA
Kui palju koopiaid on, on see absoluutne kvantifitseerimine.Tavaliselt kasutame laboris enim suhtelist kvantitatiivset meetodit.Tavaliselt,2-ΔΔct meetodkasutatakse katsetes kõige rohkem, seega tutvustatakse siin üksikasjalikult ainult seda meetodit.
2-ΔΔct meetod: Saadud tulemuseks on sihtgeeni ekspressiooni erinevus katserühmas võrreldes kontrollrühma sihtgeeni ekspressiooniga.Nõutakse, et nii sihtgeeni kui ka sisemise võrdlusgeeni amplifikatsiooniefektiivsus oleks 100% lähedal ja suhteline hälve ei tohiks ületada 5%.
Arvutusmeetod on järgmine:
Δct kontrollrühm = kontrollrühma sihtgeeni ct väärtus – kontrollrühma sisemise võrdlusgeeni ct väärtus
Δct katserühm = sihtgeeni ct väärtus katserühmas – sisemise võrdlusgeeni ct väärtus katserühmas
ΔΔct=Δct katserühm-Δct kontrollrühm
Lõpuks arvutage avaldise taseme erinevuse kordne:
Muuda Fold=2-ΔΔct (vastab Exceli funktsioonile POWER)
Seotud tooted:
Postitusaeg: 20. mai-2023
