Kõik räägivad qRT-PCR katse põhimõttest, praimeri disainist, tulemuste tõlgendamisest jne, kuid ma arvan, et peaksin teiega jagama qRT-PCR eksperimentaalset toimimist.See on väike, kuid see on seotud tulemustega.
Enne qRT-PCR tegemist peab meil olema selge arusaam oma RNA-st ja töömeetoditest.Lõppude lõpuks on meie jõupingutused suunatud tulemuste saavutamisele, mitte lihtsalt harjutamisele.Nii et enne qRT-PCR tegemist peame kindlaks tegema järgmised probleemid (mõned neist kehtivad ainult SYBR-i puhul).
1 Kas olete kindel, et teie RNA ei ole lagunenud?
NanoDrop 2000 suudab tuvastada ainult RNA kontsentratsiooni ja puhtust, kuid ei suuda tuvastada RNA terviklikkust.
RNA (RNA Intesity Number) väärtus võib kajastada RNA terviklikkust, mille tuvastab süsteem Agilent 2100 Bioanalyzer.
Joonis. Erinevate RNA proovide (eukarüootide) RIN väärtuste skemaatiline diagramm
Siiski ei ole laborites üldiselt Agilent 2100 Bioanalyzerit.Sel juhul saame tuvastada formaldehüüdgeeli kaudu, kuid RNA koguhulga nõue on kõrge, seega on kiireim meetod tavalise geelelektroforeesi kasutamine.See peab olema nukleaasivabas keskkonnas, seega on vaja elektroforeesipaaki, soolpudelit, geeliklambrit ja kammi loputada DEPC veega.Agaroos on samuti nukleaasivaba (nii kaua, kui see on värskelt avatud) ja laadimispuhver tuleks võimalikult palju värskelt avada, 1,2% geeliga.
Pange tähele, et geel peab olema täielikult lahustunud, vastasel juhul tekivad ebahomogeensed ribad, nagu on näidatud joonisel näidis 9.Kui pinge on liiga kõrge või töötab liiga kaua, tekitab see soojust ja põhjustab RNA lagunemist, seega tuleks pinget ja aega mõistlikult kontrollida.Lisaks saab geeliga töötamise abil veelgi kindlaks teha, kas proovis on DNA jääke, ja jälgida, kas jaotussüvendis on palju säilinud ribasid.
Joonis.RNA geelelektroforeesi tuvastamine
2 Kas olete oma cDNA kontsentratsioonis kindel?
Suurte vendade kogemus laboris on selline, et iga inversiooniga saadud 20 ul süsteemi cDNA lahjendatakse otse 20X, samas kui doktorikraadi lõpetanud õed 10X.Olen tavaliselt olukorrast.Kuna iga inimese mainitud RNA kvaliteet on erinev, on ka tagasipööramise tase erinev ja ümberpööramise tehnoloogia ei pruugi olla stabiilne.
Nii et iga kord, kui saan ümberpööratud cDNA, lahjendan seda kõigepealt umbes 3 korda ja seejärel kasutan RT-PCR tegemiseks majapidamisgeeni, tsüklite arv on üldiselt 25 tsüklit, et tuvastada konkreetne kontsentratsioon ja seejärel määrata lõplik lahjendustegur.
3 Kas olete kindel, et teie praimereid on lihtne kasutada?
See võib läbida qRT-PCR sulamiskõvera, kuid see maksab siiski raha.Kui laborid, kus pole palju raha, saavad nad palju praimereid hankides kasutada tavalist RT-PCR-i, et näha, kas tegemist on ühe ribaga, ja teha kindlaks praimerite spetsiifilisus.Kui laboril rahapuudust ei ole, saab sulamiskõvera kaudu ühe korra tuvastada kõigi praimerite spetsiifilisust.
4 Kas olete kindel, et teie katsetingimused on sobivad?
SYBR-i tuleks kaitsta tugeva valguse eest, nii et proovige SYBR-i reaktiivi lisamisel peatuli välja lülitada ja selle lõpetamiseks peate kasutama ainult hämarat valgust.
Säilitage SYBR-i temperatuuril 4 °C.Kasutamise ajal pöörake vahu tekkimise vältimiseks ettevaatlikult üles-alla, et segu hästi seguneks, ja ärge segage tugevalt.
Mõnele nooremale õele meeldib joonistada PCR-tahvlile märke, kuna kardavad proove segamini ajada, mis on vale.Kuna teie markerid mõjutavad suure tõenäosusega fluorestsentssignaalide kogumist, soovitan üldiselt juunioridel kasutada mälu abistamiseks eksperimentaalseid märkmikke, nagu allpool näidatud.
Joonis.qRT-PCR proovi laadimise diagramm
5 Kas olete kindel, et teete seda õigesti?
Kandke kindlasti kindaid, kandke kindaid, kandke kindaid ja öelge kolm korda olulisi asju.
SYBR-i valguse kokkupuute vähendamiseks meeldib mulle isiklikult esmalt lisada mall, nagu on näidatud alloleval joonisel.Kogemuste kohaselt põhjustab väikese koguse malli lisamine tõenäoliselt valimi võtmise vigu.Seetõttu, et minimeerida väikese koguse malli lisamisel tekkivat viga, ma tavaliselt kahekordistan proovi uuesti ja proovi lisamisel kahekordse koguse, et vähendada lisatud H2O2 kogust.
Joonis.qRT-PCR laadimise skemaatiline diagramm
Seejärel konfigureerige qRT-PCR süsteem järgmiselt.
Joonis.qRT-PCR süsteemi ettevalmistamise diagramm
MÄRKUS. Konfiguratsiooniprotsess tuleb teha jääl.
Pärast proovi lisamist kleepige läbipaistev tihenduskile.Püüdke mitte puudutada käega läbipaistva tihenduskile pinda, vaid toimige kile mõlemal küljel olevast ruumist.Kuna sõrmejäljed võivad samuti mõjutada fluorestsentssignaalide kogumist.Seejärel kasutage tsentrifuugi, et tsentrifuugida kiiresti 10 sekundit madalal kiirusel, et vältida proovi seinal rippumist.
Seotud tooted:
Postitusaeg: 28. aprill 2023
