PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) on üks in vitro DNA võimendamise tehnoloogiatest, mille ajalugu on üle 30 aasta.

PCR-tehnoloogia oli 1983. aastal teerajajaks Kary Mullis USA-st Cetus. Mullis taotles PCR-i patenti 1985. aastal ja avaldas samal aastal esimese PCR-i akadeemilise töö teaduse kohta.Mullis pälvis oma töö eest 1993. aastal Nobeli keemiaauhinna.

PCR põhiprintsiibid

PCR võib sihtmärk-DNA fragmente amplifitseerida rohkem kui miljon korda.Põhimõte on DNA polümeraasi katalüüsi all, kasutades algahela DNA-d matriitsina ja spetsiifilist praimerit pikendamise lähtepunktina.Seda replitseeritakse in vitro selliste etappide kaudu nagu denatureerimine, anniilimine ja pikendamine.Algahela matriitsi DNA-ga komplementaarse tütarahela DNA protsess.

Standardne PCR-protsess jaguneb kolmeks etapiks:

1.Denatureerimine: kasutage DNA kaksikahelate eraldamiseks kõrget temperatuuri.Vesinikside DNA kaksikahelate vahel katkeb kõrgel temperatuuril (93-98 ℃).

2. Anniilimine: Pärast kaheahelalise DNA eraldamist alandage temperatuuri, et praimer saaks seostuda üheahelalise DNA-ga.

3. Laiendamine: DNA polümeraas hakkab temperatuuri alandamisel seotud praimeritest piki DNA ahelaid sünteesima komplementaarseid ahelaid.Kui pikendamine on lõppenud, lõpeb tsükkel ja DNA fragmentide arv kahekordistub

Neid kolme sammu 25-35 korda edasi-tagasi liigutades suureneb DNA fragmentide arv eksponentsiaalselt.

PCR-i leidlikkus seisneb selles, et erinevatele sihtgeenidele saab kujundada erinevaid praimereid, nii et sihtgeeni fragmente saab lühikese aja jooksul amplifitseerida.

Seni võib PCR jagada kolme kategooriasse, nimelt tavaline PCR, fluorestsents-kvantitatiivne PCR ja digitaalne PCR.

Tavalise PCR esimene põlvkond

Kasutage sihtgeeni amplifitseerimiseks tavalist PCR-i amplifitseerimisseadet ja seejärel kasutage toote tuvastamiseks agaroosgeelelektroforeesi, teha saab ainult kvalitatiivset analüüsi.

Esimese põlvkonna PCR-i peamised puudused:

1. Aldis mittespetsiifilisele amplifikatsioonile ja valepositiivsetele tulemustele.

2.Tuvastamine võtab kaua aega ja toiming on tülikas.

3.Sooritada saab ainult kvalitatiivset testi

Teise põlvkonna reaalajas PCR

Reaalajas PCR, tuntud ka kui qPCR, kasutab fluorestsentssonde, mis võivad näidata reaktsioonisüsteemi edenemist, ja jälgib võimendatud produktide akumuleerumist fluorestsentssignaalide kogunemise kaudu ning hindab tulemusi fluorestsentskõvera kaudu.Seda saab kvantifitseerida Cq väärtuse ja standardkõvera abil.

Kuna qPCR-tehnoloogiat rakendatakse suletud süsteemis, väheneb saastumise tõenäosus ja fluorestsentssignaali saab kvantitatiivseks tuvastamiseks jälgida, seega on see kliinilises praktikas kõige laialdasemalt kasutatav ja sellest on saanud PCR-is domineeriv tehnoloogia.

Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivses PCR-is kasutatavad fluorestseeruvad ained võib jagada järgmisteks osadeks: TaqMan fluorestsentssond, molekulaarmajakad ja fluorestseeruv värv.

1) TaqMani fluorestsentssond:

PCR amplifikatsiooni ajal lisatakse spetsiifiline fluorestsentssond, lisades samal ajal praimeripaari.Sond on oligonukleotiid ja mõlemad otsad on märgistatud reporterfluorestseeruva rühma ja kustutaja fluorestseeruva rühmaga.

Kui sond on terve, neeldub reporterrühma poolt kiiratav fluorestsentssignaal summutusrühmas;PCR amplifikatsiooni ajal lõhustab ja lagundab Taq ensüümi 5'-3' eksonukleaasi aktiivsus sondi, muutes reporteri fluorestseeruva rühma ja kustutaja. Fluorestsentsrühm eraldatakse nii, et fluorestsentsi seiresüsteem saab vastu võtta fluorestsentssignaali, st iga kord, kui DNA ahelat fluorestsentsitakse, fluorestsentsi ahelat amplifitseeritakse ja aheldatakse. on täielikult sünkroniseeritud PCR produkti moodustumisega.

2) SYBR fluorestsentsvärv:

PCR reaktsioonisüsteemis lisatakse SYBR fluorestsentsvärvi liig.Pärast seda, kui SYBR fluorestsentsvärv on mittespetsiifiliselt integreeritud DNA kaheahelasse, kiirgab see fluorestsentssignaali.SYBR-i värvimolekul, mis ei ole ahelasse lülitatud, ei kiirga fluorestseeruvat signaali, tagades sellega fluorestsentssignaali. PCR-produktide arvu suurenemine on täielikult sünkroniseeritud PCR-i toodete arvu suurenemisega.SYBR seondub ainult kaheahelalise DNA-ga, seega saab sulamiskõverat kasutada selleks, et teha kindlaks, kas PCR-reaktsioon on spetsiifiline.

3) Molekulaarne majakas:

See on tüvisilmuse topeltmärgistatud oligonukleotiidsond, mis moodustab 5 ja 3 otsas umbes 8 alusest koosneva juuksenõela struktuuri.Nukleiinhappejärjestused mõlemas otsas on komplementaarselt seotud, mistõttu fluorestseeruv rühm ja kustutav rühm on tihedad.Sulgege, fluorestsentsi ei teki.

Pärast PCR-produkti genereerimist seotakse anniilimisprotsessi käigus molekulaarse majaka keskmine osa spetsiifilise DNA järjestusega ja fluorestsentsgeen eraldatakse kustutajageenist, et tekitada fluorestsents.

Teise põlvkonna PCR-i peamised puudused:

Tundlikkus on endiselt puudulik ja madala koopiaga proovide tuvastamine on ebatäpne.

Taustväärtus mõjutab ja tulemus on vastuvõtlik häiretele.

Kui reaktsioonisüsteemis on PCR inhibiitoreid, on tuvastamistulemused vastuvõtlikud häiretele.

Kolmanda põlvkonna digitaalne PCR

Digitaalne PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) arvutab sihtjärjestuse koopiaarvu lõpp-punkti tuvastamise kaudu ja suudab teostada täpset absoluutset kvantitatiivset tuvastamist ilma sisemisi kontrolle ja standardkõveraid kasutamata.

Digitaalne PCR kasutab lõpp-punkti tuvastamist ja ei sõltu Ct väärtusest (tsükli läviväärtusest), seega mõjutab amplifikatsioonitõhusus vähem digitaalset PCR reaktsiooni ning paraneb taluvus PCR reaktsiooni inhibiitorite suhtes ning see on kõrge täpsuse ja reprodutseeritavusega.

Tänu kõrgele tundlikkusele ja suurele täpsusele ei sega PCR-reaktsiooni inhibiitorid seda kergesti ning see võib saavutada tõelise absoluutse kvantifitseerimise ilma standardtoodeteta, millest on saanud uurimis- ja rakenduste leviala.

Vastavalt reaktsiooniüksuse erinevatele vormidele võib selle jagada kolmeks põhitüübiks: mikrofluid-, kiip- ja tilksüsteemid.

1) Mikrofluidiline digitaalne PCR, mdPCR:

Mikrofluiditehnoloogia põhjal eraldatakse DNA matriit.Mikrofluiditehnoloogia võib realiseerida proovi nano-uuendamise või väiksemate tilkade genereerimise, kuid tilgad vajavad spetsiaalset adsorptsioonimeetodit ja seejärel kombineeritakse PCR reaktsioonisüsteemiga.mdPCR on järk-järgult kasutusele võetud muude meetoditega.

2) Piisapõhine digitaalne PCR, ddPCR:

Kasutage proovi tilkadeks töötlemiseks vesi-õlis tilkade genereerimise tehnoloogiat ja jagage nukleiinhappemolekule sisaldav reaktsioonisüsteem tuhandeteks nanomõõtmelisteks tilkadeks, millest igaüks ei sisalda tuvastatavat nukleiinhappe sihtmolekuli või sisaldab ühte kuni mitut testitavat nukleiinhappe sihtmolekuli.

3) Kiibil põhinev digitaalne PCR, cdPCR:

Kasutage integreeritud vedelikuraja tehnoloogiat, et graveerida räniplaatidele või kvartsklaasile palju mikrotorusid ja mikroõõnsusi ning juhtida lahuse voolu läbi erinevate juhtventiilide ning jaotada proovivedelik sama suurusega nanomeetriteks digitaalse PCR-reaktsiooni jaoks reaktsioonisüvenditesse, et saavutada absoluutne kvantifitseerimine.

Kolmanda põlvkonna PCR-i peamised puudused:

Seadmed ja reaktiivid on kallid.

Malli kvaliteedinõuded on kõrged.Kui malli kogus ületab mikrosüsteemi koguse, on seda võimatu kvantifitseerida ja kui see on liiga väike, väheneb kvantifitseerimise täpsus.

Valepositiivseid tulemusi võib genereerida ka mittespetsiifilise võimenduse korral.