Kuulmislangus (HL) on inimeste kõige levinum sensoorse puudega haigus.Arenenud riikides on umbes 80% laste keeleeelsetest kurtusjuhtudest põhjustatud geneetilistest teguritest.Kõige tavalisemad on ühe geeni defektid (nagu on näidatud joonisel 1), 124 geenimutatsiooni on leitud olevat seotud mittesündroomse kuulmislangusega inimestel, ülejäänud on põhjustatud keskkonnateguritest.Sisekõrva implantaat (elektrooniline seade, mis asetatakse sisekõrva, mis annab elektrilise stimulatsiooni otse kuulmisnärvi) on kõige tõhusam võimalus raskekujulise HL-i raviks, samas kui kuuldeaparaat (väline elektrooniline seade, mis muundab ja võimendab helilaineid) võib aidata mõõduka HL-ga patsiente.Praegu pole aga päriliku HL-i (GHL) raviks ravimeid saadaval.Viimastel aastatel on geeniteraapia pälvinud üha suuremat tähelepanu kui paljulubav lähenemisviis sisekõrva düsfunktsiooni ravis.

Joonis 1.Kurtusega seotud variatsioonitüüpide jaotus.[1]

Hiljuti avaldasid Salki Instituudi ja Sheffieldi ülikooli teadlased uurimistulemuse ajakirjas Molecular Therapy – Methods & Clinical Development [2], mis näitasid päriliku kurtuse in vivo geeniteraapia laialdasi rakendusvõimalusi.Uri Mõis, Salki Instituudi teadustöö dotsent ja Waitti täiustatud biofotoonika keskuse direktor, ütles, et ta sündis raske kuulmislangusega ja tundis, et kuulmise taastamine oleks suurepärane kingitus.Tema varasemad uuringud näitasid, et Eps8 on aktiini reguleeriv valk, millel on aktiini siduv ja piirav toime;kohleaarsetes karvarakkudes eksisteerib Eps8-ga koos MYO15A, WHIRLIN, GPSM2 ja GNAI3 moodustatud valgukompleks peamiselt kõige Juuksekimpude hooldamiseks on vajalikud pikkade stereotsiiliate tipud, mis koos MYO15A-ga lokaliseerivad BAIAP2L2 lühemate stereotsiiliate otstes.Seetõttu saab Eps8 reguleerida karvarakkude stereotsiiliate pikkust, mis on normaalse kuulmisfunktsiooni jaoks hädavajalik;Eps8 deletsioon või mutatsioon põhjustab lühikesi stereotsiiliaid, mis ei võimalda heli õigesti aju tajumiseks elektrilisteks signaalideks teisendada, mis omakorda põhjustab kurtust..Samal ajal leidis Sheffieldi ülikooli professor Walter Marcotti, et karvarakud ei saa Eps8 puudumisel normaalselt areneda.Selles uuringus tegid Manor ja Marcotti koostööd, et uurida, kas Eps8 lisamine stereotsiliaarsetele rakkudele võib taastada nende funktsiooni ja omakorda parandada hiirte kuulmist.Uurimisrühm kasutas adeno-assotsieerunud viiruse (AAV) vektorit Anc80L65, et viia metsiktüüpi EPS8 sisaldav kodeeriv järjestus Eps8-/- vastsündinud P1-P2 hiirte sisekõrvasse ümara akna membraani süstimise teel;hiire kohleaarsetes karvarakkudes Stereokillide funktsioon parandati enne nende küpsemist;ja parandusefekti iseloomustas pilditehnoloogia ja stereotsiiliate mõõtmine.Tulemused näitasid, et Eps8 suurendas stereotsiilide pikkust ja taastas madala sagedusega rakkudes juukserakkude funktsiooni.Samuti leidsid nad, et aja jooksul tundusid rakud kaotavat võime selle geeniteraapia abil neid päästa.See tähendab, et seda ravi võib osutuda vajalikuks manustada emakas, kuna Eps8-/- karvarakud võivad pärast hiirte sündi olla küpsenud või kogunenud parandamatuid kahjustusi."Eps8 on valk, millel on palju erinevaid funktsioone ja seal on veel palju uurida, " ütles Manor.Tulevased uuringud hõlmavad Eps8 geeniteraapia mõju kuulmise taastamisele erinevatel arenguetappidel ning seda, kas on võimalik ravivõimalusi pikendada.Juhuslikult avaldas Iisraeli Tel Avivi ülikooli professor KarenB Avraham 2020. aasta novembris oma tulemused ajakirjas EMBO Molecular Medicine [3], kasutades uuenduslikku geeniteraapia tehnoloogiat kahjutu sünteetilise adeno-seotud viiruse AAV9-PHP loomiseks.B, Syne4-/- hiirte karvarakkude geenidefekt parandati Syne4 kodeerivat järjestust kandva viiruse süstimisega hiirte sisekõrva, võimaldades sellel siseneda karvarakkudesse ja vabastada kaasas oleva geneetilise materjali, võimaldades neil küpseda ja normaalselt funktsioneerida (nagu joonisel 2).

Joonis 2.Sisekõrva anatoomia skemaatiline esitus, keskendudes Corti organile ja nesprin-4 rakufunktsioonile.

On näha, et geeniteraapia kasutamine pärilike haiguste ravimise eesmärgi saavutamiseks geenitasandil mistahes muteerunud geenide sisestamise, eemaldamise või ravi eesmärgil korrigeerimise (st haiguse geneetiliste muutuste kontrollimise) omab kõrget kliinilist efekti.taotlemise väljavaated.Praegused geneetiliselt puuduliku kurtuse geeniteraapia meetodid võib jagada järgmistesse kategooriatesse:

geeni asendamine

Geeniasendus on vaieldamatult kõige "lihtsam" geeniteraapia vorm, mis põhineb defektse geeni tuvastamisel ja asendamisel geeni normaalse või metsikut tüüpi koopiaga.Esimene edukas sisekõrva geeniteraapia uuring vesikulaarse glutamaadi transporter 3 (VGLUT3) geeni deletsioonist põhjustatud kuulmislanguse kohta;AAV1-vahendatud eksogeense VGLUT3 üleekspressiooni kohaletoimetamine sisekõrva karvarakkudes (IHC) võib põhjustada püsiva kuulmise taastumise, osalise lindi sünaptilise morfoloogia taastumise ja krambivastuse [4].Eespool sissejuhatuses kirjeldatud kahte AAV-ga manustatud geeniasendust hõlmavates näidetes on aga oluline märkida, et teatud tüüpi geenide deletsiooni päriliku kuulmiskaotuse häirete puhul kasutatavad hiiremudelid on ajaliselt erinevad inimestest ja P1 hiirtel on sisekõrv küpses arengujärgus.Seevastu inimesed sünnivad küpse sisekõrvaga.See erinevus takistab hiire tulemuste võimalikku rakendamist inimese pärilike kurtushäirete ravis, välja arvatud juhul, kui geeniteraapiat viiakse küpsetesse hiirekõrvadesse.

Geeni redigeerimine: CRISPR / Cas9

Võrreldes “geeniasendusega” on geenide redigeerimise tehnoloogia areng toonud alguse geneetiliste haiguste ravi alustamiseks.Oluline on see, et geenide redigeerimise meetod korvab traditsiooniliste üleekspressiooniga geeniteraapia meetodite puudused, mis ei sobi domineerivate pärilike kurtushaiguste korral, ja probleemi, et üleekspressioonimeetod ei kesta kaua.Pärast seda, kui Hiina teadlased lõid Myo6WT/C442Y hiirtel AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2 geenide redigeerimissüsteemi kasutades spetsiifiliselt välja Myo6C442Y mutantse alleeli ja 5 kuu jooksul pärast koputamist, hiirtel Mudeli kuulmisfunktsioon taastati;samal ajal täheldati ka sisekõrva karvarakkude elulemuse paranemist, ripsmete kuju korrapäraseks muutumist ja elektrofüsioloogiliste näitajate korrigeerimist [5].Tegemist on esimese uuringuga maailmas, mis kasutab CRISPR/Cas9 tehnoloogiat Myo6 geenimutatsioonist põhjustatud päriliku kurtuse raviks ning tegemist on päriliku kurtuse ravi geenitöötlustehnoloogia olulise uurimistööga.Ravi kliiniline tõlge annab kindla teadusliku aluse.

Geeniteraapia kohaletoimetamise meetodid

Geeniteraapia õnnestumiseks ei suuda paljad DNA molekulid oma hüdrofiilsuse ja fosfaatrühmade negatiivse laengu tõttu tõhusalt rakkudesse tungida ning et tagada täiendatud nukleiinhappemolekulide terviklikkus, tuleb valida ohutu ja tõhus meetod.Täiendatud DNA toimetatakse sihtrakku või -koesse.AAV-d kasutatakse laialdaselt haiguste ravis kohaletoimetamise vahendina, kuna sellel on kõrge nakkav toime, madal immunogeensus ja lai tropism erinevatele koetüüpidele.Praegu on suur hulk uurimistöid määranud erinevate AAV alatüüpide tropismi hiire sisekõrva erinevate rakutüüpide suhtes.AAV kohaletoimetamisomaduste kasutamine koos rakuspetsiifiliste promootoritega võib saavutada rakuspetsiifilise ekspressiooni, mis võib vähendada sihtmärgiväliseid mõjusid.Lisaks sellele töötatakse alternatiivina traditsioonilistele AAV-vektoritele pidevalt välja uusi sünteetilisi AAV-vektoreid, mis näitavad sisekõrvas paremat transduktsioonivõimet, millest AAV2/Anc80L65 on kõige laialdasemalt kasutatav.Mitteviiruslikud kohaletoimetamise meetodid võib veel jagada füüsikalisteks meetoditeks (mikrosüstimine ja elektroporatsioon) ja keemilisteks meetoditeks (lipiidipõhised, polümeeripõhised ja kulla nanoosakesed).Mõlemat lähenemisviisi on kasutatud pärilike kurtusehäirete ravis ning neil on ilmnenud erinevad eelised ja piirangud.Lisaks geeniteraapia kui kandja kohaletoimetamisvehiikulile saab geenide in vivo manustamiseks kasutada erinevaid lähenemisviise, mis põhinevad erinevatel sihtrakkude tüüpidel, manustamisviisidel ja terapeutilisel efektiivsusel.Sisekõrva keerukas struktuur muudab sihtrakkudeni jõudmise raskeks ja genoomi redigeerivate ainete levik on aeglane.Kilejas labürint asub ajalise luu kondlikus labürindis ja hõlmab kohleaarset kanalit, poolringikujulist kanalit, utriklit ja õhupalli.Selle suhteline isolatsioon, minimaalne lümfiringe ja verest eraldamine verelabürindi barjääriga piiravad ravimite tõhusat süsteemset manustamist ainult vastsündinutele.Geeniteraapiaks sobivate viirustiitrite saamiseks on vajalik viirusvektorite otsene lokaalne süstimine sisekõrva.Väljakujunenud süstimisviiside hulka kuuluvad [6]: (1) ümaraknaline membraan (RWM), (2) trahheostoomia, (3) endolümfaatiline või perilümfaatiline kohleostoomia, (4) ümaraknaline membraan pluss toru fenestratsioon (CF) (nagu joonisel 3).

Joonis 3.Geeniteraapia sisekõrva manustamine.

Kuigi geeniteraapias on tehtud palju edusamme, tuleb kliiniliste translatsioonieesmärkide põhjal teha rohkem tööd, enne kui geeniteraapiast saab geneetiliste haigustega patsientide esmavaliku ravivõimalus, eriti ohutute ja tõhusate vektorite ning manustamismeetodi väljatöötamisel.Kuid me usume, et lähitulevikus saavad seda tüüpi ravimeetodid personaalse ravi põhiosadeks ja neil on tohutult positiivne mõju geneetiliste häiretega inimeste ja nende perede elule.

Foregene on käivitanud ka suure läbilaskevõimega sõeluuringukomplekti sihtgeenide jaoks, mis on kiire ja suudab sooritada pöördtranskriptsiooni ja qPCR reaktsioone ilma RNA ekstraheerimiseta.

Toote lingid

Cell Direct RT-qPCR komplekt – Taqman/SYBR GREEN I

Toote kohta lisateabe saamiseks võtke ühendust:

overseas@foregene.com