Molekulaardiagnostika tehnoloogia kasutab molekulaarbioloogia meetodeid, et tuvastada inimkeha ja erinevate patogeenide geneetilise materjali ekspressiooni ja struktuuri, et saavutada haiguste ennustamise ja diagnoosimise eesmärk.

Viimastel aastatel on molekulaardiagnostika tehnoloogia uuendamise ja iteratsiooniga molekulaardiagnostika kliiniline rakendamine muutunud üha ulatuslikumaks ja põhjalikumaks ning molekulaardiagnostika turg on jõudnud kiire arengu perioodi.

Autor võtab kokku turul levinud molekulaardiagnostika tehnoloogiad ning jaguneb kolmeks osaks: esimene osa tutvustab PCR tehnoloogiat, teine ​​osa nukleiinhapete isotermilise amplifikatsiooni tehnoloogiat ja teine ​​osa sekveneerimistehnoloogiat.

01

I osa: PCR-tehnoloogia

PCR tehnoloogia

PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) on üks in vitro DNA võimendamise tehnoloogiatest, mille ajalugu on üle 30 aasta.

PCR-tehnoloogia tegi 1983. aastal teerajajaks Kary Mullis USA-st Cetus.Mullis taotles PCR-i patenti 1985. aastal ja avaldas samal aastal esimese PCR-i akadeemilise töö teaduse kohta.Mullis võitis 1993. aastal Nobeli keemiaauhinna.

PCR põhiprintsiibid

PCR võib sihtmärk-DNA fragmente amplifitseerida rohkem kui miljon korda.Põhimõte seisneb selles, et DNA polümeraasi katalüüsil kasutatakse matriitsina algahela DNA-d ja pikendamise lähtepunktina kasutatakse spetsiifilist praimerit.Seda replitseeritakse in vitro selliste etappide kaudu nagu denatureerimine, anniilimine ja pikendamine.Algahela matriitsi DNA-ga komplementaarse tütarahela DNA protsess.

Standardne PCR-protsess jaguneb kolmeks etapiks:

1. Denatureerimine: kasutage DNA kaksikahelate eraldamiseks kõrget temperatuuri.DNA kaksikahelate vahelised vesiniksidemed katkevad kõrgel temperatuuril (93-98°C).

2. Lõõmutamine: Pärast kaheahelalise DNA eraldamist alandatakse temperatuuri nii, et praimer saaks seostuda üheahelalise DNA-ga.

3. Laiendamine: DNA polümeraas hakkab temperatuuri alandamisel seotud praimeritest piki DNA ahelaid sünteesima komplementaarseid ahelaid.Kui pikendamine on lõppenud, lõpeb tsükkel ja DNA fragmentide arv kahekordistub.

Neid kolme sammu 25-35 korda edasi-tagasi liigutades suureneb DNA fragmentide arv eksponentsiaalselt.

PCR-i leidlikkus seisneb selles, et erinevatele sihtgeenidele saab kavandada erinevaid praimereid, nii et sihtgeeni fragmente saab lühikese aja jooksul amplifitseerida.

Seni võib PCR jagada kolme kategooriasse, nimelt tavaline PCR, fluorestsents-kvantitatiivne PCR ja digitaalne PCR.

Tavalise PCR esimene põlvkond

Kasutage sihtgeeni amplifitseerimiseks tavalist PCR-i amplifitseerimisseadet ja seejärel kasutage toote tuvastamiseks agaroosgeelelektroforeesi, teha saab ainult kvalitatiivset analüüsi.

Esimese põlvkonna PCR-i peamised puudused:

- Aldis mittespetsiifilisele võimendusele ja valepositiivsetele tulemustele.

-Tuvastamine võtab kaua aega ja operatsioon on tülikas.

-Sooritada saab ainult kvalitatiivset testimist.

Teise põlvkonna fluorestsents-kvantitatiivne PCR

Fluorestsents-kvantitatiivset PCR-i (Real-Time PCR), tuntud ka kui qPCR, kasutatakse võimendatud produktide kuhjumise jälgimiseks fluorestsentssignaalide kogunemise kaudu, lisades fluorestseeruvaid sonde, mis võivad näidata reaktsioonisüsteemi edenemist, ja tulemuste hindamiseks fluorestsentskõvera kaudu ning Cq-väärtuse ja standardkõvera abil.

Kuna qPCR-tehnoloogiat rakendatakse suletud süsteemis, väheneb saastumise tõenäosus ja fluorestsentssignaali saab kvantitatiivseks tuvastamiseks jälgida, seega on see kliinilises praktikas kõige laialdasemalt kasutatav ja sellest on saanud PCR-is domineeriv tehnoloogia.

Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivses PCR-is kasutatavad fluorestseeruvad ained võib jagada järgmisteks osadeks: TaqMani fluorestseeruvad sondid, molekulaarmajakad ja fluorestsentsvärvid.

1) TaqMani fluorestsentssond:

PCR amplifikatsiooni ajal lisatakse spetsiifiline fluorestsentssond, lisades samal ajal praimerite paari.Sond on oligonukleotiid ja kaks otsa on vastavalt märgistatud reporterfluorestseeruva rühma ja kustutaja fluorestseeruva rühmaga.

Kui sond on terve, neeldub reporterrühma poolt kiiratav fluorestsentssignaal summutusrühmas;PCR amplifikatsiooni ajal lõhustab ja lagundab Taq ensüümi 5'-3' eksonukleaasi aktiivsus sondi, muutes reporteri fluorestseeruva rühma ja kustutaja. Fluorestsentsrühm eraldatakse nii, et fluorestsentsi seiresüsteem saab vastu võtta fluorestsentssignaali, st iga kord, kui DNA ahelat fluorestsentsitakse, fluorestsentsi ahelat amplifitseeritakse ja aheldatakse. on täielikult sünkroniseeritud PCR produkti moodustumisega.

2) SYBR fluorestseeruvad värvained:

PCR reaktsioonisüsteemis lisatakse SYBR fluorestsentsvärvi liig.Pärast seda, kui SYBR fluorestsentsvärv on mittespetsiifiliselt integreeritud DNA kaheahelasse, kiirgab see fluorestsentssignaali.SYBR-i värvimolekul, mis ei ole ahelasse lülitatud, ei kiirga fluorestseeruvat signaali, tagades sellega fluorestsentssignaali. PCR-produktide arvu suurenemine on täielikult sünkroniseeritud PCR-i toodete arvu suurenemisega.SYBR seondub ainult kaheahelalise DNA-ga, seega saab sulamiskõverat kasutada selleks, et teha kindlaks, kas PCR-reaktsioon on spetsiifiline.

3) Molekulaarsed majakad

See on tüvisilmuse topeltmärgistatud oligonukleotiidsond, mis moodustab 5 ja 3 otsas umbes 8 alusest koosneva juuksenõela struktuuri.Nukleiinhappejärjestused mõlemas otsas on komplementaarselt seotud, mistõttu fluorestseeruv rühm ja kustutav rühm on tihedad.Sulgege, see ei tekita fluorestsentsi.

Pärast PCR-produkti genereerimist seotakse anniilimisprotsessi käigus molekulaarse majaka keskmine osa spetsiifilise DNA järjestusega ja fluorestsentsgeen eraldatakse kustutajageenist, et tekitada fluorestsents.

Teise põlvkonna PCR-i peamised puudused:

Tundlikkus on endiselt puudulik ja madala koopiaga proovide tuvastamine pole täpne.

Taustväärtus on mõjutatud ja tulemus on vastuvõtlik häiretele.

Kolmanda põlvkonna digitaalne PCR

Digitaalne PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) arvutab sihtjärjestuse koopiaarvu lõpp-punkti tuvastamise kaudu ja suudab teostada täpset absoluutset kvantitatiivset tuvastamist ilma sisemisi kontrolle ja standardkõveraid kasutamata.

Digitaalne PCR kasutab lõpp-punkti tuvastamist ja ei sõltu Ct väärtusest (tsükli läviväärtusest), seega mõjutab amplifikatsioonitõhusus vähem digitaalset PCR reaktsiooni ning paraneb taluvus PCR reaktsiooni inhibiitorite suhtes ning see on kõrge täpsuse ja reprodutseeritavusega.

Tänu kõrgele tundlikkusele ja suurele täpsusele ei sega PCR-reaktsiooni inhibiitorid seda kergesti ning see võib saavutada tõelise absoluutse kvantifitseerimise ilma standardtoodeteta, millest on saanud uurimis- ja rakenduste leviala.

Vastavalt reaktsiooniüksuse erinevatele vormidele võib selle jagada kolme tüüpi: mikrofluid-, kiip- ja tilksüsteemid.