Looge PCR-katse SOP, et standardida katsepersonali käitumist.
Eksperimenteerija järgib rangelt tööprotseduure ja minimeerib inimteguritest põhjustatud PCR-saastet või hoiab ära reostuse tekkimise.Lisaks peaksid katse läbiviija omama vastavaid erialaseid teadmisi ja oskusi, sealhulgas valdama seotud seadmeid, selgeks tegema kogu tööprotsessi, valdama saasteravi meetodeid ja laboratoorseid kvaliteedikontrolli meetodeid ning oskama õigesti tõlgendada katsetulemusi.
Looge standardne PCR-labor.
PCR-labor on põhimõtteliselt jagatud neljaks valdkonnaks, nimelt reaktiivi ettevalmistamise ala, proovi töötlemise ala, amplifikatsiooniala ja amplifikatsiooniproduktide analüüsi ala.Esimesed kaks ala on võimenduseelsed alad ja kaks viimast ala on võimendusjärgsed alad.Eelvõimenduse tsoon ja järelvõimenduse tsoon peaksid olema rangelt eraldatud.Katsematerjalid, reaktiivid, salvestuspaber, pliiatsid, puhastusmaterjalid jne võivad voolata ainult eelamplifikatsioonialast amplifikatsioonijärgsesse piirkonda, st reaktiivi ettevalmistamise piirkonnast → proovi töötlemise alast → amplifikatsioonipiirkonnast → amplifikatsiooniprodukti analüüsipiirkonnast ega tohi voolata tagasi.Õhuvool laboris peaks samuti voolama võimenduseelsest piirkonnast järelvõimendusalasse, mitte tagasivoolu.Ideaalne PCR labori kujundus on näidatud allpool:
Joonis A: Ideaalne PCR labori seadistusrežiim negatiivse rõhuga puhverruumis
Joonis B: Ideaalne PCR labori seadistusrežiim positiivse rõhuga puhverruumis
Joonisel A ja joonisel B toodud PCR-i labori seadistusskeemid peaksid olema ideaalsem seadistusrežiim ja tingimustega labor võib projekteerimisel viidata sellele režiimile.Tavalistes laborites on soovitatav, et PCR amplifikatsiooniala ja tooteanalüüsi ala oleks võimalik eraldada ning proovi ettevalmistamise ja PCR amplifikatsiooni ala kaane avanemist tuleks võimalikult palju vähendada.Pidage meeles: tooteanalüüsi alas olevate toodete ja eksperimentaalsete tarvikute viimine proovi ettevalmistamise alale ja PCR amplifikatsiooni alale on rangelt keelatud.
Kui laboris tehakse ainult PCR tuvastamist ja tuvastamist, on tavapärase PCR asemel soovitatav kasutada fluorestsents-kvantitatiivset PCR-i.
Fluorestsents-kvantitatiivse PCR tuvastamise tulemusi saab koguda ja analüüsida fluorestsentssignaalide abil, seega pole pärast reaktsiooni elektroforeesi jaoks vaja kaant avada, mis väldib PCR-i produktide saastumist, mis on põhjustatud reaktsioonisaaduste lekkimisest aerosoolide moodustumiseks.Kui suurendate geelelektroforeesi laadimisetapi ajal korkide avade arvu, tekib tõenäoliselt aerosoolsaaste.Soovitatav on propageerida kvantitatiivse PCR rakendamist ja kvalitatiivne PCR järk-järgult asendada.
PCR-reaktsiooniks kasutatakse UNG anti-PCR toote saastumise süsteemi.
Süsteem kasutab dTTP asemel dUTP-d.Pärast PCR reaktsiooni liidetakse kõik PCR produktid (DNA fragmendid) dUTP-ga;PCR reaktsiooni järgmises voorus inkubeeritakse süsteemi lisatud UNG ensüümi 37 °C juures 5 minutit enne PCR-i, mis võib spetsiifiliselt lagundada kõik dUTP-d sisaldavad DNA fragmendid ja seejärel viia läbi PCR reaktsioon.See võib täielikult eemaldada PCR-toodete põhjustatud aerosoolsaaste.Mõju on näidatud alloleval joonisel:
Märkus. Otsese PCR-seeria jaoks saate valida Foregene PCR-i saastevastase süsteemi seeriatooted.Soovita
Laborites, mis viivad läbi suuremahulisi genotüpiseerimistesti, on lisaks mõistlike laborite ehitamisele tungivalt soovitatav kasutada reaktiivide testimiseks ka UNG anti-PCR toodete saastumise süsteemi.
Meeldetuletus: selle süsteemi kasutamine ei saa eemaldada juba põhjustatud PCR-i toote saastumist.Seetõttu tuleks vastava testi alguses kasutada UNG-süsteemi ja PCR-i amplifikatsiooniks UNG-süsteemi, et vältida PCR-toodete saastumist Valepositiivne.
Suuremahuliste testide läbiviimisel on soovitatav kasutada Foregene Direct PCR-UNG süsteemi, näiteks:
Plant Leaf Direct PCR komplekt-UNG；
Plant Seed Direct PCR komplekt-UNG；
Animal Tissue Direct PCR komplekt-UNG；
Mouse Tail Direct PCR komplekt-UNG；
Zebra Fish Direct PCR komplekt-UNG.
See komplektide seeria firmalt Foregeneei suuda mitte ainult kiiresti ja ulatuslikult tuvastada PCR-i, vaid ka tõhusalt ära hoida ja kontrollida PCR-produktide saastumist.
Postitusaeg: 19. märts 2021
