PCR-reaktsiooni silmapaistev omadus on selle suur võimendusvõime ja ülikõrge tundlikkus.PCR jõudluse ja tuvastamise tõhususe parandamiseks oleme pühendunud PCR amplifikatsioonivõime ja tuvastamise tundlikkuse parandamisele, kuid peavalu on katse käigus.Sageli esinevad valepositiivsed tulemused ja väga väike kogus proovi ristsaastumine või PCR-produkti saastumine võib põhjustada katses valepositiivseid tulemusi.
Viis tüüpi PCR-toodete saastumist
PCR-i saastumisel on palju põhjuseid, mille võib laias laastus jagada järgmistesse kategooriatesse:
Proovi saastumise põhjuseks on peamiselt proovi kogumiseks mõeldud anuma saastumine või proovi asetamisel lekib see lahtise tihendi tõttu konteinerist välja või proov on kleepunud anuma välisküljele, mis põhjustab ristsaastumist;Saastumine põhjustab proovide vahelist saastumist;mõned mikroobiproovid, eriti viirused, võivad levida aerosoolidega või moodustada aerosoole, mille tulemuseks on vastastikune saastumine.
Peamine põhjus on selles, et PCR-reaktiivide valmistamise ajal saastuvad proovipüstol, anum, topeltdestilleeritud vesi ja muud lahused PCR-i nukleiinhappematriitsiga.
Molekulaarbioloogia laborites ja mõnedes laborites, mis kasutavad kloonitud plasmiide positiivsete kontrollidena, on levinud ka kloonitud plasmiidide saastumise probleem.Kuna kloonimisplasmiidi sisaldus mahuühikus on küllaltki kõrge ning puhastusprotsessis on vaja rohkem tööriistu ja reaktiive ning elusrakkudes olev plasmiid on suure tõenäosusega saastunud tänu elusrakkude tugevale kasvu- ja paljunemisvõimele.
Amplifitseeritud produktide saastumine on PCR-reaktsioonide kõige levinum saasteprobleem.Kuna PCR-produkti koopiate kogus on suur (tavaliselt 1013 koopiat/ml), mis on palju suurem kui PCR-i tuvastamise koopiaarvu piir, võib väga väike kogus PCR-i produkti saastumist põhjustada valepositiivseid tulemusi.
Aerosoolsaaste on PCR-i toodete kõige tõenäolisem saastumise vorm ja seda on ka kõige lihtsam tähelepanuta jätta.See tekib vedeliku pinna ja õhu hõõrdumisel.Üldiselt võib aerosoolsaaste tekkida kaane avamisel, proovi aspireerimisel või isegi reaktsioonitoru tugeval loksutamisel.Arvutuste kohaselt võib aerosooliosakeses olla 48 000 koopiat, seega on sellest põhjustatud saaste probleem, mis väärib erilist tähelepanu.
Eelkõige kasutavad katselaborid teatud geeni testimiseks sageli sama praimerite paari.Aja jooksul toimub laboriruumis suur hulk PCR-i produktide saastumist.Kui selline saastumine tekib, on seda lühikese aja jooksul raske kõrvaldada.
Esimese kolme saastetüübi puhul saame kasutada tõhusaid vahendeid, et vältida, kuid PCR-toodete põhjustatud reostust on raske vältida, eriti mittestandardsete PCR-laborite ehitamisel.PCR-protsessis, kui pipeti ots imeb ja puhub vedelikku ning PCR-tuubi kate avatakse, tekib aerosool.Aerosooliga kaasas olevaid DNA molekule (üks aerosool võib kanda kümneid tuhandeid DNA-d) on raske kõrvaldada, kuna need hõljuvad õhus.Pärast järgmise PCR-katsete vooru sisseviimist ilmnevad paratamatult valepositiivsed tulemused.
Nagu on näidatud alloleval joonisel, võimendas negatiivne kontroll ka vastavat huvipakkuvat riba:
Siin tutvustatakse selle PCR-reostuse ja ennetamise teema esimest osa.Järgmine number toob teieni teise osa "PCR-i toodete saastumise vältimine", nii et püsige lainel!
Postitusaeg: juuli-25-2017
