Autorid: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Üksus: Jiaozhou haigla, Dongfangi haigla, mis on seotud Tongji ülikooliga

Praegu on hingamisteede patogeenide nukleiinhapete tuvastamise peamine proovitüüp kurgu tampoon.Tavaliselt kasutatakse erinevaid proovide säilitamise lahendusi, mis kõik tuleb transportimiseks ja ladustamiseks külmutada või külmutada;Kogumise ja transportimise ajal on raske kontrollida kogu madala temperatuuri protsessi ning enne proovide testimist on raske tagada kvaliteedikontrolli^[1-2].

RNaas (RNaas) on endonukleaas, mis hüdrolüüsib RNA-d, katkestades peamiselt nukleotiidide vahelisi fosfodiestersidemeid.RNaasi molekul on väga stabiilne, selle struktuuris on disulfiidsidemeid ja selle aktiivsus ei nõua kahevalentsete katioonide olemasolu, mistõttu RNaasi ei denatureerita kergesti ning seda on lihtne renatureerida ka pärast kõrget temperatuuri või denatureerivate ainete kasutamist.RNaasid jagunevad endogeenseteks ja eksogeenseteks.Endogeensed RNaasid võivad vabaneda rakkude purunemisel samal ajal.Seetõttu on endogeensete RNaaside rolli kõrvaldamine RNA ekstraheerimise protsessis väga kriitiline samm.Eksogeensed RNaasid on laialt levinud.RNaasid eksisteerivad õhus, inimese nahas, juustes ja süljes, mis on olulised põhjused RNA kergeks lagunemiseks^[3].

Andmepäring

CANS-CL02-A009 “Meditsiinilabori kvaliteedi ja pädevuse akrediteerimise juhendite rakendamine molekulaardiagnostika valdkonnas” tehnilistes nõuetes tehakse ettepanek, et vastavalt taotlusele tuleks sõnastada asjakohased veekvaliteedi standardid;Ühekordsed õhukindlad konteinerid:

RNaasi/klassifikatsioon

(1) RNaas A

Ribonukleaas A (RNaas A), mis pärineb veise kõhunäärmest, on endoribonukleaas, mis võib spetsiifiliselt rünnata RNA pürimidiinijääkide 3'-otsa, lõigates kõrvuti asetsevate nukleotiidide moodustatud tsütosiini või uratsiili.Fosfodiesterside, reaktsiooni lõppsaaduseks on 3'-pürimidiinnukleotiid ja oligonukleotiid, mille lõpus on 3'-pürimidiinnukleotiid.

(2) RNaas T1

Ribonukleaas T1 (RNase T1) pärineb Aspergillus orjzae'st, see toimib spetsiifiliselt guaniini 3'-terminaalsele fosfaadile ja lõhustamiskoht on guaniini 3'-fosfaadi ja külgnevate nukleotiidide 5'-hüdroksüülide vahel.Reaktsiooni lõppsaaduseks on 3′guanüülhape ja oligonukleotiidi fragmendid, mille lõpus on 3′guanüülhape.

(3) RNaas H

Ribonukleaas H (RNaas H) avastati esmakordselt vasika harknääre koest ja seda kodeeriv geen on kloonitud Escherichia colisse.See võib spetsiifiliselt lagundada DNA-d: RNA ahelaid RNA hübriiddupleksides, mille tulemuseks on 3'-OH ja 5'-monofosfaatotstega oligonukleotiidid ja mononukleotiidid, see ei saa lagundada ühe- või kaheahelalist DNA-d või RNA-d.

RNaasi

Funktsioon ja kasutamine

Ribonukleaas võib katalüüsida ribonukleiinhappe (RNA) lagunemist ja seda saab kunstlikult sünteesida.Ravisalvi kasutatakse paikselt traumade ja liigesevalu raviks.Aruannete kohaselt võib ribonukleaas muuta peremeesraku metabolismi, pärssida viiruse sünteesi, inhibeerida gripiviiruse proliferatsiooni in vitro ning pärssida vaktsiinia ja herpesviiruse teket kanaembrüodes.Ribonukleaasi kliiniline kasutamine 180 mg päevas intramuskulaarselt süstides, mis on kasulik epideemilise entsefaliidi raviks, võib ribonukleaas katalüüsida ribonukleiinhappe (RNA) lagunemist ja seda saab nüüd kunstlikult sünteesida.Ravisalvi kasutatakse paikselt traumade ja liigesevalu raviks.Aruannete kohaselt võib ribonukleaas muuta peremeesraku metabolismi, pärssida viiruse sünteesi, inhibeerida gripiviiruse proliferatsiooni in vitro ning pärssida vaktsiinia ja herpesviiruse teket kanaembrüodes.Ribonukleaasi kliiniline kasutamine päevas 180 mg intramuskulaarse süstina on kasulik epideemilise entsefaliidi raviks.

RNaasi

Inhibiitori määratlus

RNaasi inhibiitori ühiku määratlus: 50% RNaasi A aktiivsusest 50% inhibeerimiseks vajalik ensüümi kogus on üks ühik.

Kuidas RNaasi inhibiitorid töötavad

Guanidiini isotiotsüanaat:

Guanidiini isotiotsüanaat on orgaaniline ühend molekulvalemiga C2H6N4S.Kasutatakse peamiselt bioloogilises meditsiinis, keemilistes reagentides jne. Guanidiini isotiotsüanaat on valke lüüsiv aine ja seda kasutatakse sageli molekulaardiagnostika reagentides lüüsilahuse peamise komponendina.See võib lüüsida kudesid, hävitada rakustruktuuri ja dissotsieerida nukleiinhapet nukleoproteiinist ning sellel on tugev denaturatsioon RNaasiks.See on praegu kõige tõhusam RNaasi inhibiitor.

TRIzol on uudne totaalse RNA ekstraheerimise reaktiiv, mis suudab kogu RNA-d otse rakkudest või kudedest ekstraheerida.See sisaldab selliseid aineid nagu fenool ja guanidiini isotiotsüanaat, mis võivad rakke kiiresti lõhkuda ja rakkudest vabanevaid nukleaase pärssida.

(Siiski on guanidiini isotiotsüanaat laboriteadlaste tervisele ohtlik.)

RNasiin:

Roti maksast või inimese blastodermist ekstraheeritud happeline glükoproteiin.Rnasiin on RNaasi mittekonkureeriv inhibiitor, mis võib seostuda erinevate RNaasidega, et neid inaktiveerida.

(Lisateavet: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hkõrge temperatuur:

Kõrge temperatuur on ka tavaline valgu denatureerimise vahend.

Dietüülpürokarbonaat (DEPC):

DEPC on tugev, kuid mittetäielik RNaasi inhibiitor, mis võib valkude denatureerimiseks inhibeerida RNaasi aktiivsust, ühinedes RNaasi aktiivse rühma aminohappe imidasoolitsükliga.

Vanadüülribonukleosiidi kompleks:

Vanaadiumoksiidi ioonidest ja nukleosiididest moodustunud kompleks, mis seondub RNaasiga siirdeainetena, mis võib RNaasi aktiivsust peaaegu täielikult pärssida

muu:

Teatud RNaasi pärssiv toime on ka SDS-l, uureal, kobediatomiitmullal jne.

Ekspertide ülevaated

Li Yujie peatehnik

Tongji ülikooliga seotud Dongfangi haigla Jiaozhou haigla laboriosakonna direktor

Eksogeense RNaasi biolagunemise vältimiseks tuleks RNA ekstraheerimise käigus sageli kanda maske, kindaid ja mütse ning neid sageli vahetada.Kõiki klaasnõusid tuleb küpsetada kuivatusahjus temperatuuril 200°C üle 2 tunni.Küpsetamiseks kasutatavaid materjale, nagu plast, tuleb töödelda DEPC veega ja seejärel pesta destilleeritud veega.RNA ekstraheerimiseks, säilitamiseks ja identifitseerimiseks kasutatavad reaktiivid või seadmed peaksid olema pühendatud RNA-le ning tuleks luua sõltumatu RNA tööpiirkond.

viited:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J jt.Bakterid ja viirused ninaneelus vahetult enne ägedate alumiste hingamisteede infektsioonide tekkimist põlisrahvaste Austraalia lastel [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785–1794.

[2] Hiina ennetava meditsiini assotsiatsiooni haiglanakkuste kontrolli haru.Kliiniliste mikroobiproovide kogumise ja kontrollimise juhised [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] "Kliinilise testi kümme tuhat miks molekulaarbioloogia testimaht"