• PCR on meetod, mida kasutatakse DNA amplifitseerimiseks väikesest kogusest DNA matriitsist.RT-PCR kasutab pöördtranskriptsiooni, et toota RNA allikast DNA matriitsi, mida saab seejärel amplifitseerida.
• PCR ja RT-PCR on tavaliselt lõpp-punkti reaktsioonid, samas kui qPCR ja RT-qPCR kasutavad toote sünteesi kiiruse kineetikat PCR reaktsiooni ajal, et määrata olemasoleva matriitsi kogus.
• Uuemad meetodid, nagu digitaalne PCR, annavad esialgse DNA matriitsi absoluutse kvantifitseerimise, samas kui sellised meetodid nagu isotermiline PCR vähendavad usaldusväärsete tulemuste saamiseks vajadust kallite seadmete järele.

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on suhteliselt lihtne ja laialdaselt kasutatav molekulaarbioloogia meetod DNA ja RNA järjestuste amplifitseerimiseks ja tuvastamiseks.Võrreldes traditsiooniliste DNA kloonimise ja amplifitseerimise meetoditega, mis võivad sageli kesta päevi, nõuab PCR vaid paar tundi.PCR on väga tundlik ja nõuab spetsiifiliste järjestuste tuvastamiseks ja amplifitseerimiseks minimaalset matriitsi.Põhilised PCR-meetodid on lihtsast DNA ja RNA tuvastamisest edasi arenenud.Allpool oleme andnud ülevaate erinevatest PCR-meetoditest ja reaktiividest, mida Enzo Life Sciences teie uurimisvajaduste jaoks pakume.Meie eesmärk on aidata teadlastel kiiresti pääseda juurde PCR-reaktiividele, mida oma järgmises uurimisprojektis kasutada!

PCR

Standardse PCR jaoks on vaja ainult DNA polümeraasi, magneesiumi, nukleotiide, praimereid, amplifitseeritavat DNA matriitsi ja termotsüklirit.PCR mehhanism on sama lihtne kui selle eesmärk: 1) kaheahelaline DNA (dsDNA) denatureeritakse kuumusega, 2) praimerid joonduvad üksikute DNA ahelatega ja 3) praimereid pikendab DNA polümeraas, mille tulemuseks on kaks koopiat algne DNA ahel.Denaturatsiooni, lõõmutamise ja pikenemise protsessi erinevatel temperatuuridel ja aegadel nimetatakse üheks amplifikatsioonitsükliks (joonis 1).

Tsükli iga etapp tuleks optimeerida kasutatava malli ja praimerite komplekti jaoks.Seda tsüklit korratakse ligikaudu 20-40 korda ja seejärel saab amplifitseeritud produkti analüüsida, tavaliselt agaroosgeeliga (joonis 2).

Kuna PCR on väga tundlik meetod ja üksikute reaktsioonide jaoks on vaja väga väikeseid koguseid, on soovitatav valmistada mitme reaktsiooni jaoks põhisegu.Põhisegu tuleb hästi segada ja seejärel reaktsioonide arvu järgi jagada, tagades, et iga reaktsioon sisaldab sama palju ensüümi, dNTP-sid ja praimereid.Paljud tarnijad, näiteks Enzo Life Sciences, pakuvad ka PCR segusid, mis sisaldavad juba kõike peale praimerite ja DNA malli.

Guaniini/tsütosiinirikkad (GC-rikkad) piirkonnad kujutavad endast väljakutset standardsetes PCR-meetodites.GC-rikkad järjestused on stabiilsemad kui madalama GC-sisaldusega järjestused.Lisaks kipuvad GC-rikkad järjestused moodustama sekundaarseid struktuure, nagu juuksenõelasid.Seetõttu on GC-rikkaid kaksikahelaid denaturatsioonifaasis raske täielikult eraldada.Järelikult ei saa DNA polümeraas uut ahelat takistusteta sünteesida.Kõrgem denatureerimistemperatuur võib seda parandada ning kõrgema anniilimistemperatuuri ja lühema anniilimisaja kohandamine võib takistada GC-rikaste praimerite mittespetsiifilist seondumist.Täiendavad reaktiivid võivad suurendada GC-rikaste järjestuste võimendamist.DMSO, glütserool ja betaiin aitavad lõhkuda sekundaarseid struktuure, mis on põhjustatud GC interaktsioonidest ja hõlbustavad seeläbi kaheahelaliste ahelate eraldamist.

Hot Start PCR

Mittespetsiifiline amplifikatsioon on probleem, mis võib ilmneda PCR-i ajal.Enamik PCR-i jaoks kasutatavaid DNA polümeraase töötab kõige paremini temperatuuril umbes 68–72 °C.Ensüüm võib aga olla aktiivne ka madalamatel temperatuuridel, kuigi madalamal määral.Temperatuuridel, mis on palju alla anniilimistemperatuuri, võivad praimerid seostuda mittespetsiifiliselt ja viia mittespetsiifilise amplifikatsioonini, isegi kui reaktsioon toimub jääl.Seda saab ära hoida, kasutades polümeraasi inhibiitoreid, mis dissotsieeruvad DNA polümeraasist alles siis, kui teatud temperatuur on saavutatud, sellest tuleneb termin hot start PCR.Inhibiitoriks võib olla antikeha, mis seob polümeraasi ja denatureerub algsel denaturatsioonitemperatuuril (tavaliselt 95 °C).

High Fidelity Polymerase

Kuigi DNA polümeraasid võimenduvad üsna täpselt algse matriitsi järjestusega, võib nukleotiidide sobitamisel esineda vigu.Mittevastavus sellistes rakendustes nagu kloonimine võib põhjustada kärbitud transkripte ja valesti transleeritud või inaktiivseid valke allavoolu.Nende mittevastavuste vältimiseks on tuvastatud ja töövoogu kaasatud polümeraasid, millel on korrektuur.Esimene korrektuurpolümeraas, Pfu, tuvastati 1991. aastal Pyrococcus furiosuses.Sellel Pfu ensüümil on 3' kuni 5' eksonukleaasi aktiivsus.Kui DNA amplifitseeritakse, eemaldab eksonukleaas ahela 3'-otsast sobimatud nukleotiidid.Seejärel asendatakse õige nukleotiid ja DNA süntees jätkub.Valede nukleotiidjärjestuste tuvastamine põhineb õige nukleosiidtrifosfaadi seondumisafiinsusel ensüümiga, kus ebaefektiivne seondumine aeglustab sünteesi ja võimaldab õiget asendamist.Pfu polümeraasi korrektuuri aktiivsus põhjustab Taq DNA polümeraasiga võrreldes vähem vigu lõppjärjestuses.Viimastel aastatel on tuvastatud teisi korrektuuri ensüüme ning tehtud on algse Pfu ensüümi modifikatsioone, et veelgi vähendada veamäära DNA amplifikatsiooni ajal.

RT-PCR

Pöördtranskriptsiooni PCR ehk RT-PCR võimaldab kasutada RNA-d matriitsina.Täiendav samm võimaldab tuvastada ja amplifitseerida RNA-d.RNA pöördtranskribeeritakse komplementaarseks DNA-ks (cDNA), kasutades pöördtranskriptaasi.RNA matriitsi kvaliteet ja puhtus on RT-PCR õnnestumiseks olulised.RT-PCR esimene samm on DNA/RNA hübriidi süntees.Pöördtranskriptaasil on ka RNaasi H funktsioon, mis lagundab hübriidi RNA osa.Üheahelalise DNA molekuli täiendab seejärel pöördtranskriptaasi DNA-st sõltuv DNA polümeraasi aktiivsus cDNA-ks.Esimese ahela reaktsiooni efektiivsus võib mõjutada amplifikatsiooniprotsessi.Edaspidi kasutatakse cDNA amplifitseerimiseks standardset PCR-protseduuri.Võimalusel muuta RNA RT-PCR abil cDNA-ks on palju eeliseid ja seda kasutatakse peamiselt geeniekspressiooni analüüsiks.RNA on üheahelaline ja väga ebastabiilne, mis muudab sellega töötamise keeruliseks.Tavaliselt toimib see esimese sammuna qPCR-is, mis kvantifitseerib RNA transkripte bioloogilises proovis.

qPCR ja RT-qPCR

Kvantitatiivset PCR-i (qPCR) kasutatakse nukleiinhapete tuvastamiseks, iseloomustamiseks ja kvantifitseerimiseks paljudes rakendustes.RT-qPCR-is kvantifitseeritakse RNA transkripte sageli pöördtranskribeerimise teel cDNA-sse, nagu ülalpool kirjeldatud, ja seejärel viiakse läbi qPCR.Nagu standardse PCR-i puhul, amplifitseeritakse DNA-d kolme korduva etapiga: denatureerimine, anniilimine ja pikendamine.Kuid qPCR-is võimaldab fluorestsentsmärgistus koguda andmeid PCR-i edenedes.Sellel tehnikal on saadaolevate meetodite ja keemiavaliku tõttu palju eeliseid.

Värvipõhises qPCR-is (tavaliselt roheline) võimaldab fluorestseeruv märgistus amplifitseeritud DNA molekulide kvantifitseerimist, kasutades dsDNA-d siduvat värvi.Iga tsükli jooksul mõõdetakse fluorestsentsi.Fluorestsentssignaal suureneb proportsionaalselt replitseeritud DNA kogusega.Seega on DNA kvantifitseeritud "reaalajas" (joonis 3).Värvipõhise qPCR-i puudused on see, et korraga saab uurida ainult ühte sihtmärki ja värv seondub mis tahes proovis sisalduva ds-DNA-ga.

Sondipõhises qPCR-is saab igas proovis samaaegselt tuvastada paljusid sihtmärke, kuid see nõuab lisaks praimeritele kasutatava(te) sihtmärgispetsiifiliste sondi(de) optimeerimist ja kavandamist.Saadaval on mitut tüüpi sondi konstruktsioone, kuid kõige levinum tüüp on hüdrolüüsisond, mis sisaldab fluorofoori ja kustutajat.Fluorestsentsresonantsenergia ülekanne (FRET) takistab fluorofoori emissiooni kustutaja kaudu, kui sond on terve.Kuid PCR reaktsiooni käigus hüdrolüüsitakse sond praimeri pikendamise ja spetsiifilise järjestuse, millega see on seotud, amplifitseerimise ajal.Sondi lõhustamine eraldab fluorofoori kustutajast ja toob kaasa amplifikatsioonist sõltuva fluorestsentsi suurenemise (joonis 4).Seega on sondipõhise qPCR reaktsiooni fluorestsentssignaal võrdeline proovis oleva sondi sihtjärjestuse kogusega.Kuna sondipõhine qPCR on spetsiifilisem kui värvipõhine qPCR, kasutatakse seda sageli qPCR-põhistes diagnostilistes analüüsides.

Isotermiline võimendus

Ülalmainitud PCR-meetodid nõuavad kalleid termotsükliseadmeid, et kambri temperatuure denatureerimise, lõõmutamise ja pikendamise etapis täpselt üles ja alla tõsta.On välja töötatud mitmeid tehnikaid, mis ei vaja nii täpseid seadmeid ja mida saab teostada lihtsas veevannis või isegi huvipakkuvates rakkudes.Neid tehnikaid nimetatakse ühiselt isotermiliseks võimendamiseks ja need põhinevad eksponentsiaalsel, lineaarsel või kaskaadvõimendusel.

Tuntuim isotermilise võimenduse tüüp on loop-mediated isothermal amplification ehk LAMP.LAMP kasutab matriitsi DNA või RNA amplifitseerimiseks eksponentsiaalset amplifikatsiooni temperatuuril 65 °C.LAMP-i läbiviimisel kasutatakse uue DNA sünteesimiseks koos DNA polümeraasiga nelja kuni kuut sihtmärk-DNA piirkondadega komplementaarset praimerit.Kahel neist praimeritest on komplementaarsed järjestused, mis tunnevad ära teistes praimerites olevad järjestused ja seovad neid, võimaldades äsja sünteesitud DNA-s moodustuda "silmus" struktuur, mis aitab seejärel praimeri anniilimist järgmistes amplifikatsioonivoorudes.LAMP-i saab visualiseerida mitme meetodi abil, sealhulgas fluorestsentsi, agaroosgeelelektroforeesi või kolorimeetriaga.Toote olemasolu või puudumise visualiseerimise ja tuvastamise lihtsus kolorimeetria abil ning vajalike kallite seadmete puudumine muutis LAMP-i sobivaks võimaluseks SARS-CoV-2 testimiseks piirkondades, kus kliinilised laboriuuringud ei olnud kergesti kättesaadavad või proovide ladustamiseks ja transportimiseks. ei olnud teostatav või laborites, kus varem ei olnud PCR termotsükli seadmeid.