Mitu revolutsioonilist leiutist avastamistehnoloogia ajaloos on minu meelest antigeeni-antikeha spetsiifilise sidumise põhimõttel põhinev immunomärgistamise tehnoloogia, PCR tehnoloogia ja sekveneerimistehnoloogia.Täna räägime PCR-tehnoloogiast.Vastavalt PCR-tehnoloogia arengule jagavad inimesed PCR-tehnoloogia tavaliselt kolme põlvkonda: tavaline PCR-tehnoloogia, reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR-tehnoloogia ja digitaalne PCR-tehnoloogia.
Clevinud PCR tehnika
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis leiutas polümeraasi ahelreaktsiooni (polümeraasi ahelreaktsioon, PCR) 1983. aastal. Väidetavalt tekkis tal tüdruksõbra roolis olles ootamatult inspiratsioon ja ta mõtles PCR põhimõttele (sõidu eelistest).Kary Mullis pälvis Nobeli keemiaauhinna 1993. aastal. New York Times kommenteeris: "Väga originaalne ja oluline, jagades bioloogia peaaegu PCR-eelseks ja PCR-järgseks ajastuks.
PCR põhimõte: DNA polümeraasi katalüüsil kasutatakse matriitsina emaahela DNA-d ja pikendamise lähtepunktina spetsiifilist praimerit ning emaahela matriitsi DNA-ga komplementaarne tütarahela DNA kopeeritakse in vitro denatureerimise, anniilimise, pikendamise ja muude etappide kaudu.See on DNA sünteesi amplifitseerimise tehnoloogia in vitro, mis suudab kiiresti ja spetsiifiliselt amplifitseerida mis tahes sihtmärk-DNA-d in vitro.
Tavalise PCR eelised
1.Klassikaline meetod, täielikud rahvusvahelised ja kodumaised standardid
2.Instrumentide reaktiivide madalam hind
3.PCR-produkte saab koguda muude molekulaarbioloogiliste katsete jaoks
Soovitatav Foregene PCR masin: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Seotud tooted: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Tavalise PCR-i puudused
1.lihtne saastada
2.tülikas operatsioon
3.ainult kvalitatiivne analüüs
4.Mõõdukas tundlikkus
5.Esineb mittespetsiifiline võimendus ja kui mittespetsiifiline riba on sihtribaga sama suur, ei saa seda eristada
Capillaarelektroforeesil põhinev PCR
Vastuseks tavalise PCR-i puudustele on mõned tootjad kasutusele võtnud kapillaarelektroforeesi põhimõttel põhinevad instrumendid.Elektroforeesi etapp pärast PCR amplifikatsiooni on kapillaaris lõpetatud.Tundlikkus on suurem ning MAERKERi abil saab eristada mitme aluse erinevust ja võimenduse arvutada.toote sisu.Puuduseks on see, et PCR-toode tuleb siiski avada ja seadmesse panna ning endiselt on suur saastumise oht.
CapillaarEelektroforees
2. Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) tehnoloogiaFluorestsents-kvantitatiivne PCR, mida nimetatakse ka reaalajas PCR-iks, on uus nukleiinhapete kvantitatiivne tehnoloogia, mille töötas välja PE (Perkin Elmer) 1995. aastal. Fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-i arengulugu on hiiglaste, nagu ABI, Roche ja Bio-Rad, hinge segavate võitluste ajalugu.Kui on huvi, siis saab üle vaadata.See meetod on praegu kõige küpsem ja laialdasemalt kasutatav poolkvantitatiivne PCR-meetod.
Soovitatav qPCR-masin: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorestsentsvärvi meetod (SYBR Green I):SYBR Green I on kvantitatiivse PCR jaoks kõige sagedamini kasutatav DNA-d siduv värv, mis seondub mittespetsiifiliselt kaheahelalise DNA-ga.Vabas olekus kiirgab SYBR Green nõrka fluorestsentsi, kuid pärast kaheahelalise DNA-ga seondumist suureneb selle fluorestsents 1000 korda.Seetõttu on reaktsioonist väljastatav kogu fluorestseeruv signaal võrdeline olemasoleva kaheahelalise DNA kogusega ja suureneb amplifitseeritud produkti suurenedes.Kuna värvaine seondub mittespetsiifiliselt kaheahelalise DNA-ga, võivad tekkida valepositiivsed tulemused.
Seotud tooted: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Fluorestsentssondi meetod (Taqmani tehnoloogia): ajalPCR amplifikatsioonil lisatakse spetsiifiline fluorestsentssond samaaegselt praimerite paariga.Sond on lineaarne oligonukleotiid, mille mõlemas otsas on vastavalt märgistatud fluorestseeruv reporterrühm ja fluorestseeruv kustutajarühm.Kui sond on terve, neeldub reporterrühma poolt kiiratav fluorestsentssignaal kustutajarühmas ja tuvastamine Fluorestsentssignaal puudub;PCR amplifikatsiooni ajal (pikendusfaasis) seedib ja lagundab Taq ensüümi 5'-3' Dicer aktiivsus sondi, nii et reporterfluorestseeruv rühm ja kustutaja fluorestseeruv rühm on eraldatud, nii et fluorestsentsi jälgimissüsteem saab vastu võtta fluorestsentssignaali, st iga kord, kui moodustub DNA ahel, mille sünkroniseerimine on lõppenud. fluorestseeruvate signaalide ja PCR-produktide moodustumine.Taqmani sondimeetod on kliinilises tuvastamises kõige sagedamini kasutatav avastamismeetod.
Seotud tooted: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR eelised
1.Meetod on küps ning tugiseadmed ja reaktiivid on komplekteeritud
2.Reaktiivide keskmine hind
3.lihtne kasutada
4.Kõrge tuvastamise tundlikkus ja spetsiifilisus
qPCR-i puudused
Sihtgeeni mutatsioon viib tuvastamata jätmiseni.
Madala kontsentratsiooniga malli tuvastamise tulemust ei saa määrata.
Standardkõvera kasutamisel kvantitatiivseks tuvastamiseks on suur viga.
3. Digital PCR (digital PCR, dPCR) tehnoloogia
Digitaalne PCR on meetod nukleiinhappemolekulide absoluutseks kvantifitseerimiseks.Võrreldes qPCR-iga saab digitaalse PCR abil otse lugeda DNA/RNA molekulide arvu, mis on lähteproovis sisalduvate nukleiinhappemolekulide absoluutne kvantifitseerimine.1999. aastal pakkusid Bert Vogelstein ja Kenneth W. Kin-zler ametlikult välja dPCR kontseptsiooni.
2006. aastal oli Fluidigm esimene, kes tootis kaubandusliku kiibipõhise dPCR-instrumendi.2009. aastal tõi Life Technologies turule OpenArray ja QuantStudio 12K Flex dPCR süsteemid.2013. aastal tõi Life Technologies turule QuantStudio 3DdPCR süsteemi, mis kasutab suure tihedusega nanoskaala mikrofluidkiibi tehnoloogiat proovide ühtlaseks jaotamiseks 20 000 üksikule rakule.reaktsioonikaevus.
2011. aastal tõi Bio-Rad turule tilgapõhise QX100 dPCR-instrumendi, mis kasutab vesi-õlis tehnoloogiat, et jaotada proov ühtlaselt 20 000 tilk-vesi-õlis, ning tilkade analüüsimiseks tilkade analüsaatorit.2012. aastal tõi RainDance turule kõrgsurvegaasil töötava RainDrop dPCR instrumendi, et jagada iga standardne reaktsioonisüsteem reaktsiooniemulsiooniks, mis sisaldab 1–10 miljonit pikoliitri tasemel mikrotilka.
Seni on digitaalne PCR moodustanud kaks peamist fraktsiooni: kiibi tüüp ja tilgatüüp.Olenemata sellest, millist digitaalset PCR-i kasutatakse, on selle põhiprintsiibid lahjenduse piiramine, lõpp-punkti PCR ja Poissoni jaotus.Nukleiinhappematriitse sisaldav standardne PCR-reaktsioonisüsteem jaguneb ühtlaselt kümneteks tuhandeteks PCR-reaktsioonideks, mis jaotatakse kiipidele või mikrotilkadele, nii et iga reaktsioon sisaldab võimalikult palju matriitsmolekuli ja viiakse läbi ühe molekuliga matriitsi PCR-reaktsioon.Fluorestsentsi lugemine Signaali olemasolu või puudumine loendatakse ja absoluutne kvantifitseerimine tehakse pärast statistilise Poissoni jaotuse kalibreerimist.
Järgmised on mitme digitaalse PCR-platvormi omadused, mida olen kasutanud:
1. Bio-Rad QX200 piiskade digitaalne PCR Bio-RadQX200 on väga klassikaline digitaalne PCR-platvorm, põhiline tuvastamisprotsess: 20 000 proovi genereeritakse tilgageneraatoriga Vesi-õlis mikrotilgad võimendatakse tavalisel PCR-aparaadil ja lõpuks loeb iga mikrotilga fluorestsentssignaali mikropiiskade lugeja.Operatsioon on keerulisem ja reostusoht on keskmine.
Xinyi TD1 mikropiiskade digitaalne PCRXinyi TD1 on kodumaine digitaalne PCR-platvorm, põhiline tuvastamisprotsess: genereerida tilkade generaatori kaudu 30 000–50 000 vesi-õlis tilka, võimendada tavalisel PCR-instrumendil ja lõpuks läbida. Tilgalugeja loeb iga tilga fluorestsentssignaali.Nii tilkade tekitamine kui ka lugemine sellel platvormil toimub spetsiaalses kiibis, millel on madal saastumise oht.
STILLA Naica mikropiiskade digitaalne PCRSTILLA Naica on suhteliselt uus digitaalne PCR-platvorm.Põhiline tuvastamisprotsess on järgmine: lisage kiibile reaktsioonilahus, asetage kiip mikrotilkade genereerimis- ja võimendussüsteemi ning genereerige 30 000 mikrotilka.Levitage kiibile ja PCR-i võimendamine on kiibil lõpule viidud.Seejärel kantakse võimendatud kiip mikrotilkade lugemise analüüsisüsteemi ja fluorestsentssignaali loetakse pildistades.Kuna kogu protsess toimub suletud kiibis, on saastumise oht väike.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D kiip digitaalne PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D on veel üks klassikaline kiibil põhinev digitaalne PCR-platvorm.Selle tuvastamise põhiprotsess on järgmine: lisage reaktsioonilahus laoturisse ja jaotage reaktsioonilahus ühtlaselt kiibile 20 000 mikrosüvendiga läbi laoturi., asetage kiip PCR-masinale võimendamiseks ja lõpuks asetage kiip lugejasse ja tehke fluorestsentssignaali lugemiseks foto.Operatsioon on suhteliselt keeruline ja kogu protsess toimub suletud kiibis ning saastumise oht on väike.
5. JN MEDSYS Clarity kiip digitaalne PCR
JN MEDSYS Clarity on suhteliselt uus kiibi tüüpi digitaalne PCR-platvorm.Selle tuvastamise põhiprotsess on järgmine: lisage reaktsioonilahus aplikaatorisse ja jaotage reaktsioonilahus ühtlaselt 10 000 PCR-tuubi, mis on fikseeritud PCR-katsutisse, läbi aplikaatori.Mikropoorsel kiibil siseneb reaktsioonilahus kapillaartegevuse kaudu kiibile ja PCR-toru koos kiibiga asetatakse võimendamiseks PCR-masinale ning lõpuks asetatakse kiip lugejasse, et fluorestsentssignaali foto tegemise teel lugeda.Operatsioon on keerulisem.Saastumise oht on madal.
Iga digitaalse PCR-platvormi parameetrid on kokku võetud järgmiselt:
Digitaalse PCR-platvormi hindamisnäitajad on: jagatud ühikute arv, fluorestsentskanalite arv, töö keerukus ja saastumise oht.Kuid kõige olulisem on tuvastamise täpsus.Üks võimalus digitaalsete PCR-platvormide hindamiseks on kasutada üksteise kontrollimiseks mitut digitaalset PCR-platvormi ja teine võimalus on kasutada täpsete väärtustega standardaineid.
dPCR eelised
1.Absoluutse kvantifitseerimise saavutamine
2.Kõrgem tundlikkus ja spetsiifilisus
3.Suudab tuvastada madala koopiaga proove
dPCR-i puudused1. Kallid seadmed ja reaktiivid 2. Keeruline töö ja pikk tuvastamisaeg 3. Kitsas tuvastamisulatus
Praegu on kolmel PCR-tehnoloogia põlvkonnal omad eelised ja puudused ning igaühel neist on oma kasutusvaldkonnad ning see ei ole suhe, et üks põlvkond asendab teist.Tehnoloogia pidev areng on süstinud PCR-tehnoloogiasse uut elujõudu, võimaldades sellel avada ühe rakendussuuna teise järel, muutes nukleiinhapete tuvastamise mugavamaks ja täpsemaks.
Allikas: Dr Yuan viib teid testimisele
Soovitatavad tooted:
Postitusaeg: 18.11.2022
