Lähtematerjal: RNA
Kvantitatiivne pöördtranskriptsiooni PCR (RT-qPCR) on eksperimentaalne meetod, mida kasutatakse PCR-katsetes, kasutades lähtematerjalina RNA-d.Selle meetodi puhul transkribeeritakse kogu RNA või messenger RNA (mRNA) kõigepealt pöördtranskriptaasi abil komplementaarseks DNA-ks (cDNA).Seejärel viidi läbi qPCR reaktsioon, kasutades matriitsina cDNA-d.RT-qPCR-i on kasutatud mitmesugustes molekulaarbioloogia rakendustes, sealhulgas geeniekspressiooni analüüsis, RNA interferentsi valideerimises, mikrokiibi valideerimises, patogeenide tuvastamises, geneetilises testimises ja haiguste uurimises.
Ühe- ja kaheetapilised meetodid RT-qPCR jaoks
RT-qPCR-i saab läbi viia ühe- või kaheetapilise meetodiga.Üheetapiline RT-qPCR ühendab pöördtranskriptsiooni ja PCR amplifikatsiooni, võimaldades pöördtranskriptaasil ja DNA polümeraasil reaktsiooni lõpule viia samas katseklaasis samades puhvertingimustes.Üheastmeline RT-qPCR nõuab ainult järjestusspetsiifiliste praimerite kasutamist.Kaheetapilises RT-qPCR-is viiakse pöördtranskriptsioon ja PCR amplifikatsioon läbi kahes katseklaasis, kasutades erinevaid optimeeritud puhvreid, reaktsioonitingimusi ja praimerite kavandamise strateegiaid.
| Eelis | Puudus | |
| Üks samm | Sellel meetodil on vähem katsevigu, kuna mõlemad reaktsioonid viiakse läbi ühes katseklaasis
Vähem pipeteerimisetappe vähendab saastumise ohtu
Sobib suure läbilaskevõimega võimendamiseks/sõelumiseks, kiire ja reprodutseeritav | Kaheastmelisi reaktsioone ei saa eraldi optimeerida
Kuna kaheetapilise reaktsiooni kombineerimine kahjustab reaktsioonitingimusi, ei ole tundlikkus nii hea kui kaheetapilise meetodi puhul
Ühe prooviga tuvastatud sihtmärkide arv on väike |
| Kaks sammu | Võimalus luua stabiilseid cDNA raamatukogusid, mida saab säilitada pikka aega ja kasutada mitmes reaktsioonis
Sihtgeene ja võrdlusgeene saab amplifitseerida samast cDNA raamatukogust, ilma et oleks vaja mitut cDNA raamatukogu
Reaktsioonipuhvrid ja reaktsioonitingimused, mis võimaldavad optimeerida üksikuid reaktsioonikäike
Päästikutingimuste paindlik valik | Mitme katseklaasi ja rohkemate pipeteerimisetappide kasutamine suurendab DNA-ga saastumise ohtu, ja aeganõudev.
Nõuab rohkem optimeerimist kui üheastmeline meetod |
Seotud tooted:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Roheline I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Üks samm)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master eelsegu esimese ahela CDNA sünteesiks
Reaalajas PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I komplekt
Kogu RNA ja mRNA valik
RT-qPCR katse kavandamisel on oluline otsustada, kas kasutada pöördtranskriptsiooni mallina totaalset RNA-d või puhastatud mRNA-d.Kuigi mRNA võib olla võimeline andma veidi suuremat tundlikkust, kasutatakse siiski sageli kogu RNA-d.Selle põhjuseks on asjaolu, et totaalsel RNA-l on lähteainena olulisem eelis kui mRNA-l.Esiteks nõuab protsess vähem puhastamisetappe, mis tagab malli parema kvantitatiivse taastumise ja tulemuste parema normaliseerimise lähterakkude arvuga.Teiseks väldib see mRNA rikastamise etappi, mis võib vältida erinevate mRNA-de erineva taastumise tõttu moonutatud tulemuste võimalust.Üldiselt, kuna enamikes rakendustes on sihtgeeni suhteline kvantifitseerimine olulisem kui tuvastamise absoluutne tundlikkus, on kogu RNA enamikul juhtudel sobivam.
Pöördtranskriptsiooni praimer
Kaheetapilise meetodi puhul saab cDNA reaktsiooni praimimiseks kasutada kolme erinevat meetodit: oligo(dT) praimereid, juhuslikke praimereid või järjestusspetsiifilisi praimereid.Tavaliselt kasutatakse oligo(dT) praimereid ja juhuslikke praimereid kombinatsioonis.Need praimerid anniilduvad matriitsi mRNA ahelaga ja annavad sünteesi lähtepunktiks pöördtranskriptaasi.
| Praimeri valik | Struktuur ja funktsioon | Eelis | Puudus |
| Oligo(dT) praimer (või ankurdatud oligo(dT) praimer) | Pikendatud anniilimine tümiini jääkidega mRNA polü(A) sabas;ankur oligo(dT) praimer sisaldab G, C või A 3' otsas (ankurduskoht) | Täispika cDNA süntees polü(A)-sabaga mRNA-st
Kohaldatav, kui saadaval on vähem lähtematerjali
Ankurduskoht tagab, et oligo(dT) praimer seondub mRNA 5' polü(A) sabaga | Sobib ainult polü(A) sabaga geenide amplifitseerimiseks
Hankige polü(A) praimimiskohast*2 kärbitud cDNA
Kallutatud siduma 3′ otsaga*
*See võimalus on minimeeritud, kui kasutatakse ankurdatud oligo(dT) praimereid |
| juhuslik praimer
| 6 kuni 9 aluse pikkused, mis võivad RNA transkriptsiooni ajal liituda mitme saidiga | Ühendage kõigi RNA-dega (tRNA, rRNA ja mRNA)
Sobib olulise sekundaarse struktuuriga transkriptsioonide jaoks või kui saadaval on vähem lähtematerjali
Kõrge cDNA saagis | cDNA pöördtranskribeeritakse kogu RNA-st, mida tavaliselt ei soovitata ja mis võib sihtmärk-mRNA signaali lahjendada
saada kärbitud cDNA |
| järjestus-spetsiifilised praimerid | Kohandatud praimerid, mis on suunatud spetsiifilistele mRNA järjestustele | spetsiifiline cDNA raamatukogu
Parandage tundlikkust
PöördqPCR praimerite kasutamine | Piiratud ainult ühe sihtgeeni sünteesiga |
Pöördtranskriptaas
Pöördtranskriptaas on ensüüm, mis kasutab DNA sünteesimiseks RNA-d.Mõnedel pöördtranskriptaasidel on RNaasi aktiivsus ja need võivad pärast transkriptsiooni lagundada RNA ahelaid RNA-DNA hübriidahelates.Kui sellel ei ole RNaasi ensümaatilist aktiivsust, võib qPCR-i suurema efektiivsuse saavutamiseks lisada RNaasH.Tavaliselt kasutatavad ensüümid hõlmavad Moloney hiire leukeemia viiruse pöördtranskriptaasi ja linnu müeloblastoomi viiruse pöördtranskriptaasi.RT-qPCR jaoks on ideaalne valida suurema termostabiilsusega pöördtranskriptaas, et cDNA sünteesi saaks teostada kõrgematel temperatuuridel, tagades kõrgema sekundaarstruktuuriga RNA-de eduka transkriptsiooni, säilitades samas nende täieliku aktiivsuse kogu reaktsiooni vältel, mille tulemuseks on suurem cDNA saagis.
Seotud tooted:
Foreasy M-MLV pöördtranskriptaas
Pöördtranskriptaasi RNaas H aktiivsus
RNaseH on võimeline lagundama RNA ahelaid RNA-DNA dupleksidest, võimaldades kaheahelalise DNA tõhusat sünteesi.Pika mRNA kasutamisel matriitsina võib RNA aga enneaegselt laguneda, mille tulemuseks on kärbitud cDNA.Seetõttu on sageli kasulik minimeerida RNaasH aktiivsust cDNA kloonimise ajal, kui soovitakse pikkade transkriptide sünteesi.Seevastu RNaasi H aktiivsusega pöördtranskriptaasid on qPCR rakenduste jaoks sageli kasulikud, kuna need suurendavad RNA-DNA duplekside sulamist PCR esimese tsükli ajal.
Krundi disain
RT-qPCR-i qPCR-etapi jaoks kasutatavad PCR-praimerid peaksid ideaaljuhul olema konstrueeritud nii, et need hõlmaksid eksoni-eksoni ristmikku, kus amplifikatsioonipraimer võib potentsiaalselt ulatuda tegeliku eksoni-introni piirini.Kuna intronit sisaldavaid genoomse DNA järjestusi ei amplifitseerita, vähendab see disain genoomse DNA saastumise tõttu amplifitseeritud valepositiivsete tulemuste riski.
Kui praimereid ei saa kavandada eksonite või eksonite-eksonite piiride eraldamiseks, võib genoomse DNA saastumise eemaldamiseks olla vajalik töödelda RNA proove RNaasivaba DNaas I või dsDNaasiga.
RT-qPCR kontroll
DNA saastumise (nt genoomse DNA või varasemate reaktsioonide PCR-produktide) tuvastamiseks tuleks kõikidesse RT-qPCR katsetesse kaasata pöördtranskriptsiooni negatiivne kontroll (-RT kontroll).See kontroll sisaldab kõiki reaktsioonikomponente, välja arvatud pöördtranskriptaas.Kuna selle kontrolliga pöördtranskriptsiooni ei toimu, on PCR-i amplifikatsiooni täheldamisel kõige tõenäolisem DNA-ga saastumine.
Postitusaeg: august 02-2022
