Ülevaade
Transgeensete taimede kiire tuvastamine
Tekst / Tong Yucheng
Eksperimentaalne operatsioon / Han Ying
Toimetaja / Wen Youjun
Sõnad/1600+
Soovitatav lugemisaeg/8-10 minutit
Transgeensete taimede kiire tuvastamine
Uue tulijana laboris ei ole hea töö madala konversioonimääraga taimede hulgast positiivseid taimi välja sõeluda.Esiteks tuleb suurest hulgast proovidest ükshaaval DNA eraldada ja seejärel tuvastatakse võõrgeenid PCR abil.Tulemused on aga sageli tühjad ja triibud, kus on aeg-ajalt mõni üksus, kuid võimatu on kindlaks teha, kas tuvastatakse vastamata või on vale tuvastamine..Kas sellise eksperimentaalse protsessi ja tulemustega silmitsi seismine on väga abitu?Ärge muretsege, vend õpetab teile, kuidas transgeenseid positiivseid taimi lihtsalt ja täpselt välja sõeluda.
Samm 1: Disain tuvastamise praimerid
Määrake tuvastatav endogeenne geen ja eksogeenne geen vastavalt testitavale proovile ja valige praimeri kujundamiseks esinduslik 100–500 bp järjestus.Head praimerid võivad tagada tuvastamistulemuste täpsuse ja lühendada tuvastamisaega (tavaliselt kasutatavaid tuvastuspraimereid vt lisast).
Märge:
Uued praimerid peavad optimeerima reaktsioonitingimusi ja kontrollima tuvastamise täpsust, täpsust ja avastamispiiri enne suuremahulise tuvastamise teostamist.
2. samm:Töötage välja katseprotokoll
Positiivne kontroll: kasutage sihtfragmenti sisaldavat puhastatud DNA-d matriitsina, et teha kindlaks, kas PCR reaktsioonisüsteem ja tingimused on normaalsed.
Negatiivne/tühi kontroll: kasutage DNA matriitsi või ddH2O, mis ei sisalda matriitsina sihtmärkfragmenti, et tuvastada, kas PCR-süsteemis on saasteallikas.
Sisemine võrdluskontroll: kasutage testitava proovi endogeense geeni praimeri/sondi kombinatsiooni, et hinnata, kas matriitsi saab PCR-ga tuvastada.
Märge:
Iga katse jaoks tuleks määrata positiivsed, negatiivsed/tühjad kontrollid ja sisekontrollid, et hinnata katsetulemuste paikapidavust.
3. samm: Eksperimendi ettevalmistamine
Enne kasutamist jälgige, kas lahus on ühtlaselt segunenud.Kui leitakse sadet, tuleb see enne kasutamist lahustada ja segada vastavalt juhistele.2×PCR-segu tuleb enne kasutamist pipeteerida ja korduvalt mikropipetiga segada, et vältida ioonide ebaühtlast jaotumist.
Märge:
Võtke juhised välja ja lugege need hoolikalt läbi ning tehke enne katset ettevalmistusi rangelt vastavalt juhistele.
4. samm: valmistage ette PCR reaktsioonisüsteem
Vastavalt katseprotokollile segage praimerid, H2O, 2 × PCR segage, tsentrifuugige ja jagage need igasse reaktsioonituubi.
Märge:
Suuremahuliseks või pikaajaliseks testimiseks on soovitatav kasutada UNG ensüümi sisaldavat PCR-reaktsioonisüsteemi, mis võimaldab tõhusalt vältida PCR-toodete põhjustatud aerosoolsaastet.
5. samm: lisage reaktsioonimall
Otsese PCR-tehnoloogia abil ei ole vaja tüütut nukleiinhapete puhastamise protsessi.Proovimatriitsi saab valmistada 10 minuti jooksul ja lisada vastavasse PCR reaktsioonisüsteemi.
Märge:
Lüüsimeetodil on parem tuvastamise efekt ja saadud toodet saab kasutada mitmeks tuvastamisreaktsiooniks.
5.1: lehtede otsene PCR
Vastavalt juhendis oleva pildi suurusele lõigake 2-3mm läbimõõduga lehekude ja asetage see PCR reaktsioonisüsteemi.
Märkus. Veenduge, et lehefragmendid on täielikult PCR reaktsioonilahusesse sukeldatud ja ärge lisage liigset lehekudet.
5.2: Lehtede lüüsi meetod
Lõika 5-7 mm läbimõõduga lehekude ja aseta see tsentrifuugitorusse.Kui valite küpsed lehed, vältige lehe põhiveeni kudede kasutamist.Pipeteerige 50 ul puhver P1 lüsaati tsentrifuugituubi, et lüsaat saaks lehekoe täielikult sukelduda, asetage see termotsüklerisse või metallvanni ja lüüsige 95 °C juures 5–10 minutit.
Lisage 50 ul puhvri P2 neutraliseerimislahust ja segage hästi.Saadud lüsaati saab kasutada matriitsina ja lisada PCR reaktsioonisüsteemi.
Märkus. Matriitsi kogus peaks olema vahemikus 5–10% PCR-süsteemist ega tohi ületada 20% (näiteks 20 μl PCR süsteemis lisage 1–2 μl lüüsipuhvrit, mitte rohkem kui 4 μl).
6. etapp: PCR reaktsioon
Pärast PCR-reaktsioonituubi tsentrifuugimist asetage need amplifitseerimiseks PCR-seadmesse.
Märge:
Reaktsioonis kasutatakse amplifikatsiooniks puhastamata matriitsi, seega on amplifikatsioonitsüklite arv 5-10 tsüklit rohkem kui puhastatud DNA matriitsi kasutamisel.
7. samm: elektroforeesi tuvastamine ja tulemuste analüüs
M: 100 bp DNA redel
1\4: Puhastatud DNA meetod
2\5: Otsene PCR meetod
3\6: tühi juht
Kvaliteedi kontroll:
Katses seatud erinevate kontrollide testitulemused peaksid vastama järgmistele tingimustele.Vastasel juhul tuleks probleemi põhjust analüüsida ja pärast probleemi kõrvaldamist test uuesti läbi viia.
Tabel 1. Erinevate kontrollrühmade normaalsed testitulemused
*Kui plasmiidi kasutatakse positiivse kontrollina, võib endogeense geeni testi tulemus olla negatiivne
Tulemuse otsus:
A. Proovi endogeense geeni testitulemus on negatiivne, mis näitab, et proovist ei saa eraldada tavaliseks PCR-i tuvastamiseks sobivat DNA-d või ekstraheeritud DNA sisaldab PCR-reaktsiooni inhibiitoreid ja DNA tuleks uuesti ekstraheerida.
B. Proovi endogeense geeni testitulemus on positiivne ja eksogeense geeni testi tulemus negatiivne, mis näitab, et proovist on eraldatud tavaliseks PCR-i tuvastamiseks sobiv DNA ja võib otsustada, et proovis ei tuvastata XXX geeni.
C. Proovi endogeense geeni testi tulemus on positiivne ja eksogeense geeni testi tulemus on positiivne, mis näitab, et proovist on eraldatud tavaliseks PCR-i tuvastamiseks sobiv DNA ja proovi DNA sisaldab geeni XXX.Kinnituskatseid saab teha edasi.
8. samm: kujundage tuvastamispraimerid
Pärast katset kasutage katseala pühkimiseks 2% naatriumhüpokloriti ja 70% etanooli lahust, et vältida keskkonna saastumist.
Lisa
Tabel 2. Üldkasutatavad praimerid geneetiliselt muundatud taimede üldiseks PCR tuvastamiseks
Viitedokument:
SN/T 1202-2010, Kvalitatiivne PCR tuvastamise meetod geneetiliselt muundatud taimsete koostisosade jaoks toidus.
Põllumajandusministeeriumi teadaanne 1485-5-2010, Geneetiliselt muundatud taimede ja nende saaduste koostisainete testimine - riis M12 ja selle derivaadid.
Postitusaeg: juuni-09-2021