RT-qPCR on välja töötatud tavalisest PCR-tehnoloogiast.See lisab fluorestseeruvad kemikaalid (fluorestseeruvad värvained või fluorestseeruvad sondid) traditsioonilisele PCR-reaktsioonisüsteemile ning tuvastab PCR-i lõõmutamise ja pikendamise protsessi reaalajas vastavalt nende erinevatele luminestsentsmehhanismidele.Fluorestsentssignaali muutusi söötmes kasutatakse produkti muutuse suuruse arvutamiseks igas PCR-i tsüklis.Praegu on levinumad meetodid fluorestsentsvärvi meetod ja sondimeetod.

Fluorestsentsvärvi meetod:
Mõned fluorestsentsvärvid, nagu SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO jne, ei kiirga iseenesest valgust, vaid kiirgavad fluorestsentsi pärast seondumist dsDNA väiksema soonega.Seetõttu ei suuda masin PCR-reaktsiooni alguses fluorestsentssignaali tuvastada.Kui reaktsioon liigub edasi anniilimise-pikenemise (kaheetapiline meetod) või pikendamisetappi (kolmeetapiline meetod), avatakse sel ajal topeltahelad ja uus DNA polümeraas Keedu sünteesi käigus ühendatakse fluorestseeruvad molekulid dsDNA väiksemas soones ja kiirgavad fluorestsentsi.PCR-i tsüklite arvu suurenedes kombineeritakse üha rohkem värvaineid dsDNA-ga ja ka fluorestsentssignaal paraneb pidevalt.Võtke näiteks SYBR Green Ⅰ.
Sondi meetod:
Taqmani sond on kõige sagedamini kasutatav hüdrolüüsisond.Sondi 5′ otsas on fluorestseeruv rühm, tavaliselt FAM.Sond ise on sihtgeeniga komplementaarne järjestus.Fluorofoori 3'-otsas on fluorestseeruv summutusrühm.Vastavalt fluorestsentsresonantsenergia ülekande põhimõttele (Försteri resonantsenergia ülekanne, FRET), kui reporterfluorestseeruv rühm (doonorfluorestsentsmolekul) ja kustutav fluorestseeruv rühm (aktseptorfluorestsentsmolekul) Kui ergastusspekter kattub ja kaugus on väga lähedal (7-10 nm) doonori fluorestsents- või aktseptsioonimolekul. ule, samas kui autofluorestsents on nõrgenenud.Seetõttu ei kiirga reporterfluorestseeruv rühm PCR reaktsiooni alguses, kui sond on süsteemis vaba ja puutumatu, fluorestsentsi.Lõõmutamisel seostuvad praimer ja sond malliga.Pikendamise etapis sünteesib polümeraas pidevalt uusi ahelaid.DNA polümeraasil on 5′-3′ eksonukleaasi aktiivsus.Sondi jõudes hüdrolüüsib DNA polümeraas sondi matriitsist, eraldab reporterfluorestseeruva rühma kustutaja fluorestsentsrühmast ja vabastab fluorestsentssignaali.Kuna sondi ja malli vahel on üks-ühele seos, on sondimeetod testi täpsuse ja tundlikkuse poolest värvimeetodist parem.

Joonis 1 qRT-PCR põhimõte

Krundi disain
Põhimõtted:

Praimerid peaksid olema konstrueeritud nukleiinhappeseeria konserveeritud piirkonnas ja olema spetsiifilised.

Parim on kasutada cDNA järjestust ja vastuvõetav on ka mRNA järjestus.Kui ei, siis uurige DNA järjestuse cds piirkonna kujundust.
Fluorestseeruva kvantitatiivse produkti pikkus on 80-150 bp, pikim on 300 bp, praimeri pikkus on üldiselt 17-25 alust ning erinevus ülesvoolu ja allavoolu praimerite vahel ei tohiks olla liiga suur.

G+C sisaldus on 40–60% ja 45–55% on parim.
TM väärtus on vahemikus 58-62 kraadi.
Püüdke vältida praimerite dimeere ja isedimeere, (mitte ilmuvad rohkem kui 4 järjestikust komplementaarset alust) juuksenõela struktuur, kui see on vältimatu, tehke ΔG<4,5kJ/mol* Kui te ei saa tagada, et gDNA on pöördtranskriptsiooni käigus eemaldatud Clean, on kõige parem kujundada praimerid piirkondadest, millesse on modifitseeritud, intronid ei saa vältida, G rich can not be *3 /C, A/G pideva struktuuriga (2-3) praimerid ja mitte
spetsiifiline Heterogeenselt amplifitseeritud järjestuse homoloogia on eelistatavalt alla 70% või sellel on 8 komplementaarse aluse homoloogia.
Andmebaas:
CottonFGD otsing märksõnade järgi
Krundi disain:
IDT-qPCR praimeri disain

Joonis 2 IDT veebipõhise kruntvärvi kujundamise tööriista leht

Joonis 3 tulemuslehe kuva
LncRNA praimerite disain:
lncRNA:samad sammud nagu mRNA.
miRNA:Tüviahela meetodi põhimõte: kuna kõik miRNA-d on lühikesed, umbes 23 nt pikkused järjestused, ei saa otsest PCR-i tuvastamist teostada, seetõttu kasutatakse tüviahela järjestuse tööriista.Tüve-silmusjärjestus on umbes 50 nt üheahelaline DNA, mis võib iseenesest moodustada juuksenõela struktuuri.3 'Otsa saab kujundada miRNA osalise fragmendiga komplementaarse järjestusena, seejärel saab sihtmärk-miRNA ühendada tüviahela järjestusega pöördtranskriptsiooni ajal ja kogupikkus võib ulatuda 70 bp-ni, mis on kooskõlas qPCR-iga määratud amplifitseeritud produkti pikkusega.Saba miRNA praimeri disain .
Amplifikatsioonispetsiifiline tuvastamine:
Veebipõhine plahvatuse andmebaas: CottonFGD lööklaine järjestuse sarnasuse järgi
Kohalik lööklaine: vaadake Blast+ kasutamist kohaliku blasti tegemiseks, linux ja macos saavad otse luua kohaliku andmebaasi, win10 süsteemi saab teha ka pärast ubuntu bashi installimist.Looge kohalik lööklaine andmebaas ja kohalik lööklaine;avage ubuntu bash win10-s.
Märkus: mäestikupuuvill ja meresaarte puuvill on tetraploidsed põllukultuurid, nii et lõhkemise tulemuseks on sageli kaks või enam tikku.Varem leiti NAU cd-de andmebaasina blasti tegemiseks tõenäoliselt kaks homoloogset geeni, millel on vaid mõned SNP erinevused.Tavaliselt ei saa kahte homoloogset geeni praimeri disainiga eraldada, seega käsitletakse neid samadena.Kui esineb ilmselge indel, projekteeritakse praimer tavaliselt indelile, kuid see võib viia praimeri sekundaarse struktuurini. Vaba energia muutub suuremaks, mis toob kaasa võimenduse efektiivsuse vähenemise, kuid see on vältimatu.

Praimeri sekundaarse struktuuri tuvastamine:
Sammud:ava oligo 7 → sisestusmallide jada → sulge alamaken → salvesta → leidke mallil praimer, praimeri pikkuse määramiseks vajutage klahvikombinatsiooni ctrl+D → analüüsige erinevaid sekundaarstruktuure, nt isedimeriseerumise keha, heterodimeer, juuksenõel, sobimatus jne. Joonise 4 kaks viimast pilti on praimerite testi tulemused.Eesmise praimeri tulemus on hea, puudub selge dimeeri ja juuksenõela struktuur, puuduvad pidevad üksteist täiendavad alused ja vaba energia absoluutväärtus on väiksem kui 4,5, samas kui tagumine praimer näitab pidevat. 6 alust on üksteist täiendavad ja vaba energia on 8,8;lisaks ilmub 3′ otsa tõsisem dimeer ja 4 järjestikuse aluse dimeer.Kuigi vaba energia ei ole kõrge, võib 3′ dimeer Chl tõsiselt mõjutada võimenduse spetsiifilisust ja võimenduse efektiivsust.Lisaks on vaja kontrollida juuksenõelte, heterodimeeride ja mittevastavust.

Joonis 3 oligo7 tuvastamise tulemused
Võimendi efektiivsuse tuvastamine:
PCR-reaktsiooni amplifikatsioonitõhusus mõjutab tõsiselt PCR-i tulemusi.Ka qRT-PCR-is on amplifikatsiooni efektiivsus kvantitatiivsete tulemuste jaoks eriti oluline.Eemaldage reaktsioonipuhvrist muud ained, masinad ja protokollid.Praimerite kvaliteet mõjutab oluliselt ka qRT-PCR amplifikatsiooni efektiivsust.Tulemuste täpsuse tagamiseks peavad nii suhtelise fluorestsentsi kvantifitseerimise kui ka absoluutse fluorestsentsi kvantifitseerimine tuvastama praimerite amplifikatsioonitõhususe.On teada, et efektiivne qRT-PCR võimenduse efektiivsus on vahemikus 85% kuni 115%.On kaks meetodit.
1. Standardkõvera meetod:
a.Segage cDNA
b.Gradiendi lahjendus
c.qPCR
d.Lineaarse regressiooni võrrand võimenduse efektiivsuse arvutamiseks
2. LinRegPCR
LinRegPCR on programm reaalajas RT-PCR andmete analüüsimiseks, mida nimetatakse ka kvantitatiivseteks PCR (qPCR) andmeteks, mis põhinevad SYBR Greenil või sarnasel keemial.Programm kasutab mitte-algtaseme korrigeeritud andmeid, teostab iga proovi jaoks eraldi algtaseme korrigeerimise, määrab lineaarsusakna ja seejärel kasutab lineaarset regressioonianalüüsi, et sobitada sirgjoon läbi PCR-i andmekogumi.Selle joone kalde põhjal arvutatakse iga üksiku proovi PCR efektiivsus.PCR-i keskmist efektiivsust amplikoni kohta ja Ct väärtust proovi kohta kasutatakse lähtekontsentratsiooni arvutamiseks proovi kohta, väljendatuna suvalistes fluorestsentsühikutes.Andmete sisestamine ja väljastamine toimub Exceli tabeli kaudu.Ainult näidis
segamine on vajalik, gradient puudub
vajalikud sammud:(Võtke näiteks Bole CFX96, mitte päris selge ABI-ga masin)
katse:see on standardne qPCR katse.
qPCR andmeväljund:LinRegPCR suudab ära tunda kahte väljundfaili vormi: RDML või kvantifitseerimise võimenduse tulemus.Tegelikult on see tsükli numbri ja fluorestsentssignaali reaalajas tuvastamise väärtus masina poolt ning võimendus saadakse lineaarse segmendi efektiivsuse fluorestsentsi muutuse väärtuse analüüsimisel.
Andmete valik: Teoreetiliselt peaks RDML väärtus olema kasutatav.Arvatakse, et minu arvuti probleem seisneb selles, et tarkvara ei suuda RDML-i ära tunda, seega on mul algandmeteks exceli väljundväärtus.Soovitatav on esmalt läbi viia andmete umbkaudne sõelumine, näiteks proovide lisamise ebaõnnestumine jne. Väljundandmetest saab punkte kustutada (muidugi ei saa te neid kustutada, LinRegPCR ignoreerib neid punkte hilisemas etapis)

Joonis 5 qPCR andmete eksport

Joonis 6 kandidaatnäidiste valik

Andmesisestus:Ava kvalifikatsioonivõimenduse tulemused.xls, → ava LinRegPCR → fail → loe excelist → vali parameetrid, nagu näidatud joonisel 7 → OK → klõpsake nuppu määra baasjooned

Joonis 7 linRegPCR andmete sisestamise sammud

Tulemus:Kui kordamist ei toimu, pole rühmitamist vaja.Kordumise korral saab rühmitust muuta näidisrühmituses ning geeni nimi sisestatakse identifikaatorisse ning seejärel grupeeritakse automaatselt sama geen.Lõpuks klõpsake failil, eksportige Excel ja vaadake tulemusi.Kuvatakse iga süvendi võimenduse efektiivsus ja R2 tulemused.Teiseks, kui jagate rühmadesse, kuvatakse korrigeeritud keskmine võimendusefektiivsus.Veenduge, et iga praimeri amplifikatsioonitõhusus oleks vahemikus 85% kuni 115%.Kui see on liiga suur või liiga väike, tähendab see, et praimeri võimendusefektiivsus on halb.

Joonis 8 Tulemus ja andmeväljund

Katseprotsess:
RNA kvaliteedinõuded:
Puhtus:1.72,0 näitab, et seal võib olla isotiotsüanaadi jääke.Puhas nukleiinhape A260/A230 peaks olema umbes 2 . Kui 230 nm juures on tugev neeldumine, näitab see, et seal on orgaanilisi ühendeid, nagu fenaadioonid.Lisaks saab seda tuvastada 1,5% agaroosgeeli elektroforeesiga.Suunake marker, kuna ssRNA-l ei ole denaturatsiooni ja molekulmassi logaritmil pole lineaarset seost ning molekulmassi ei saa õigesti väljendada.Kontsentratsioon: teoreetiliseltmittealla 100 ng/ul, kui kontsentratsioon on liiga madal, on puhtus üldiselt madal, mitte kõrge

Joonis 9 RNA geel

Lisaks, kui proov on hinnaline ja RNA kontsentratsioon kõrge, on soovitatav see pärast ekstraheerimist alikvootideks jagada ja RNA pöördtranskriptsiooniks lahjendada lõppkontsentratsioonini 100–300 ng/ul.sissepöördtranskriptsiooni protsess, kui mRNA transkribeeritakse, kasutatakse pöördtranskriptsiooniks oligo (dt) praimereid, mis võivad spetsiifiliselt seostuda polüA sabadega, samas kui lncRNA ja circRNA kasutavad kogu RNA pöördtranskriptsiooniks juhuslikke heksameeri (juhuslik 6 mer) praimereid. MiRNA puhul kasutatakse miRNA-spetsiifilisi neck-loop-praimerite jaoks.Paljud ettevõtted on nüüdseks turule toonud spetsiaalsed sabamiskomplektid.Tüviahela meetodi puhul on saba meetod mugavam, suure läbilaskevõimega ja reaktiivi säästvam, kuid sama perekonna miRNA-de eristamise mõju ei tohiks olla nii hea kui tüviahela meetod.Igal pöördtranskriptsiooni komplektil on nõuded geenispetsiifiliste praimerite (tüvesilmuste) kontsentratsioonile.MiRNA jaoks kasutatav sisemine viide on U6.Stem-loop inversiooni käigus tuleks U6 toru eraldi ümber pöörata ning U6 esi- ja tagakrunt tuleks lisada otse.Nii tsircRNA kui ka lncRNA võivad kasutada HKG-sid sisemise võrdlusalusena.sissecDNA tuvastamine,
kui RNA-ga probleemi pole, peaks ka cDNA korras olema.Kui aga püüeldakse katse täiuslikkuse poole, on kõige parem kasutada sisemist võrdlusgeeni (referentsgeen, RG), mis suudab eristada gDNA-d cd-dest.Üldiselt on RG majapidamisgeen., HKG), nagu on näidatud joonisel fig 10;Sel ajal valmistasin sojaoa säilitusvalku ja kasutasin sisemise võrdlusalusena aktin7 sisaldavaid introneid.Selle praimeri amplifitseeritud fragmendi suurus gDNA-s oli 452 bp ja kui matriitsina kasutati cDNA-d, oli see 142 bp.Seejärel leiti testitulemustes, et osa cDNA-st oli tegelikult saastunud gDNA-ga, samuti tõestati, et pöördtranskriptsiooni tulemusega pole probleeme ja seda saab kasutada PCR-i mallina.Agaroosgeeli elektroforeesi otse cDNA-ga käivitamine on mõttetu ja see on hajus riba, mis ei ole veenev.

Joonis fig 10 cDNA tuvastamine

qPCR tingimuste määraminekomplekti protokolli kohaselt pole see üldiselt probleem, peamiselt tm väärtuse etapis.Kui mõned praimerid ei ole praimeri kujundamise ajal hästi kavandatud, mille tulemuseks on suur erinevus tm väärtuse ja teoreetilise 60 °C vahel, on soovitatav cDNA Pärast proovide segamist läbi viia praimeritega gradient-PCR ja püüda vältida temperatuuri määramist ilma ribadeta TM väärtusena.

Andmete analüüs

Tavaline suhtelise fluorestsentsi kvantitatiivne PCR-töötlusmeetod vastab põhimõtteliselt punktile 2-ΔΔCT.Andmetöötluse mall.

Seotud tooted:

Reaalajas PCR lihtne^TM – Taqman

Reaalajas PCR lihtne^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (peamine eelsegu esimese ahela cDNA sünteesiks)

RT Easy II (peamine eelsegu esimese ahela cDNA sünteesiks qPCR jaoks)