COVID-19 on raske ägeda respiratoorse sündroomi 2. tüüpi koroonaviiruse põhjustatud nakkushaigus. Kui inimene on nakatunud, on kõige sagedasemateks sümptomiteks palavik, köha ja õhupuudus.

Testimiseks kasutatavaid proove saab koguda nina-neelu tampooniga või orofarüngeaalsete tampoonidega.

Mis on PCR?

Koronaviiruse tuvastamise standardmeetod on polümeraasi ahelreaktsioon, PCR.Seda meetodit kasutatakse laialdaselt molekulaarbioloogias.See suudab kiiresti kopeerida miljoneid kuni miljardeid spetsiifilisi DNA fragmente.

Uus koroonaviirus sisaldab väga pikka üheahelalist RNA genoomi.Nende viiruste tuvastamiseks PCR abil tuleb RNA molekulid pöördtranskriptaasi abil muuta nende komplementaarseteks DNA järjestusteks ja seejärel saab äsja sünteesitud DNA-d amplifitseerida standardsete PCR protseduuride abil, mida üldiselt tuntakse RT-PCR nime all.

RT-PCR protsess

RNA ekstraheerimine

Selle meetodi läbiviimiseks tuleks viiruse RNA põhimõtteliselt ekstraheerida.Mugavaks, kiireks ja tõhusaks eraldamiseks saab kasutada mitmesuguseid RNA puhastuskomplekte.

Viiruse RNA ekstraheerimiseks kaubandusliku komplekti abil lisage proov esmalt mikrotsentrifuugi katseklaasi ja seejärel segage see lüüsipuhvriga.See puhver on tugevalt denatureeritud ja koosneb tavaliselt fenoolist ja guanidiini isotiotsüanaadist.Lisaks on lüüsipuhvris tavaliselt RNaasi inhibiitorid, et tagada intaktse viiruse RNA eraldamine.

Pärast lüüsipuhvri lisamist segage segamistoru pulssiga ja inkubeerige toatemperatuuril.Seejärel viirus lüüsitakse tugevalt denatureerivates tingimustes, mis on tagatud lüüsipuhvriga.

Pärast proovi lüüsimist kasutatakse puhastamiseks tsentrifuugitoru.Proov laaditakse tsentrifuugitorusse ja seejärel tsentrifuugitakse.

See protseduur on tahkefaasiline ekstraheerimismeetod, mille puhul statsionaarne faas koosneb silikageeli maatriksist.

Optimaalsete soola- ja pH-tingimuste korral seonduvad RNA molekulid ränidioksiidi membraaniga.

Samal ajal eemaldatakse valk ja muud saasteained.

Pärast tsentrifuugimist pange tsentrifuugitoru puhtasse kogumiskatsuti, visake filtraat ära ja lisage seejärel pesupuhver.

Asetage katseklaas uuesti tsentrifuugi, et suruda pesupuhver läbi membraani.See eemaldab membraanilt kõik ülejäänud lisandid, jättes silikageeliga seotuks ainult RNA.

Pärast proovi pesemist asetage katseklaas puhtasse mikrotsentrifuugi katsutisse ja lisage elueerimispuhver.

Seejärel tsentrifuugitakse, et suruda elueerimispuhver läbi membraani.Elueerimispuhver eemaldab tsentrifuugimiskolonnist viiruse RNA ja saadakse puhastatud RNA, mis ei sisalda valke, inhibiitoreid ja muid saasteaineid.

2. SAMM

Segatud kontsentraat

Pärast viiruse RNA ekstraheerimist on järgmiseks etapiks reaktsioonisegu ettevalmistamine PCR amplifikatsiooniks.Selles etapis kasutatakse kontsentraati.See kontsentreeritud lahus on eelsegatud kontsentreeritud lahus, mis koosneb eelsegust, pöördtranskriptaasist, nukleotiididest, päripidisest praimerist, pöördpraimerist, TaqMani sondist ja DNA polümeraasist.

Lõpuks lisatakse reaktsioonisegu lõpuleviimiseks RNA matriits.Katseklaasid segatakse pulsskeerisega ja seejärel laaditakse reaktsioonisegu PCR-plaadile.PCR-plaat sisaldab tavaliselt 96 süvend ja suudab analüüsida mitut proovi korraga.

3. SAMM

PCR amplifikatsioon

Järgmisena asetage plaat PCR-masinasse, mis on sisuliselt termotsükler.

Reaalajas RT-PCR-i kasutatakse 2019. aasta uudse koroonaviiruse tuvastamiseks, võimendades sihtjärjestust RdrRP geenis, E geenis ja N geenis.Sihtgeeni valik sõltub praimerist ja sondi järjestusest.

RT-PCR esimene samm on pöördtranskriptsioon.Sünteesitakse komplementaarse DNA esimene ahel, mille käivitab PCR pöördpraimer, mis seondub viiruse RNA genoomi komplementaarse osaga.Seejärel lisab pöördtranskriptaas praimeri 3'-otsa DNA nukleotiidid, et sünteesida viiruse RNA-ga komplementaarne DNA.Selle etapi temperatuur ja kestus sõltuvad kasutatavatest praimeritest, sihtmärk-RNA-st ja pöördtranskriptaasist.

Järgmisena rakendatakse esialgne denaturatsioonietapp, mille tulemuseks on RNA-DNA hübriidi denatureerimine.See samm on vajalik DNA polümeraasi aktiveerimiseks.Samal ajal inaktiveeritakse pöördtranskriptaas.

PCR koosneb termiliste tsüklite seeriast.Iga tsükkel koosneb denatureerimise, lõõmutamise ja pikendamise etappidest.

Denatureerimisetapp hõlmab reaktsioonikambri kuumutamist temperatuurini 95 kraadi Celsiuse järgi ja selle kasutamist kaheahelalise DNA matriitsi denatureerimiseks.

Järgmises etapis alandatakse reaktsiooni temperatuuri 58 kraadini Celsiuse järgi, võimaldades pärisuunalisel praimeril anniilida selle üheahelalise DNA matriitsi komplementaarse osaga.Lõõmutamistemperatuur sõltub otseselt praimeri pikkusest ja koostisest.

Pikendusetapis sünteesib DNA polümeraas uue DNA ahela, mis on komplementaarne DNA matriitsi ahelaga.Lisades reaktsioonisegust 5′ kuni 3′ suunas matriitsiga komplementaarseid vabu tuumasid.Selle etapi temperatuur sõltub kasutatavast DNA polümeraasist.

Pärast esimest tsüklit saadakse kaheahelaline DNA sihtmärk.

Seejärel sisestage teine ​​tsükkel.Kaheahelaline DNA denatureeritakse, et saada kaks üheahelalist DNA molekuli.

Järgmises etapis alandatakse reaktsiooni temperatuuri, praimerid anniilitakse iga üheahelalise DNA matriitsiga ja Taq-mani sond anniilitakse sihtmärk-DNA komplementaarse osaga.

TaqMani sond koosneb fluorofoorist, mis on kovalentselt seotud oligonukleotiidsondi 5'-otsaga.Tsükleri valgusallika poolt ergastatud fluorofoor kiirgab fluorestsentsi.Lisaks koosneb sond 3' otsas olevast kustutajast.Reportergeeni lähedus kustutajale takistab fluorestsentsi tuvastamist.

Pikendusetapis sünteesib DNA polümeraas uue ahela.Kui polümeraas jõuab TaqMani sondi, lõhustab selle endogeenne 5′nukleaasi aktiivsus sondi, eraldades värvaine kustutajast.

Iga PCR tsükliga vabaneb rohkem värvimolekule, mille tulemuseks on fluorestsentsi intensiivsuse suurenemine proportsionaalselt sünteesitud amplikonide arvuga.

See meetod võimaldab hinnata proovis esineva antud järjestuse arvu.Kaheahelaliste DNA fragmentide arv kahekordistub igas tsüklis.Seetõttu saab PCR-i kasutada väga väikeste proovide analüüsimiseks.

Luminofoorsignaali, volframhalogeenlambi, ergastusfiltri, reflektori, läätse, emissioonifiltri ja laenguga ühendatud seadme mõõtmiseks kasutage CCD-kaamerat.

SAMM 4 Tuvastage

Luminofoorsignaali, volframhalogeenlambi, ergastusfiltri, reflektori, läätse, emissioonifiltri ja laenguga ühendatud seadme mõõtmiseks kasutage CCD-kaamerat.

Lambi filtreeritud valgus peegeldub reflektorist, läbib kondensaatoriläätse ja fokusseeritakse iga augu keskele.Seejärel peegeldub august eralduv fluorestsents peeglist, läbib emissioonifiltri ja tuvastab CCD-kaamera.Igas PCR-tsüklis saab CCD abil tuvastada iseergastuvat fluorofoori valgust.

See muudab jäädvustatud valguse digitaalseteks andmeteks.Seda meetodit nimetatakse reaalajas PCR-iks ja see võimaldab reaalajas jälgida PCR-reaktsiooni kulgu.