PCR, mitmekordne PCR, In situ PCR, Pöörd-PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

Selgitame välja erinevate PCR-ide kontseptsioonid, etapid ja üksikasjad

Ⅰ. PCR

Polümeraasi ahelreaktsioon, mida nimetatakse PCR-ks, on molekulaarbioloogiline tehnoloogia, mida kasutatakse spetsiifiliste DNA fragmentide suurendamiseks.Seda võib pidada spetsiaalseks DNA replikatsiooniks in vitro.DNA polümeraas (DNA polümeraas I) avastati juba 1955. aastal ning E. Coli Klenowi fragmendi, millel on eksperimentaalne väärtus ja praktilisus, avastas dr H. Klenow 1970. aastate alguses, kuid kuna see ensüüm ei talu temperatuuri, võib kõrge temperatuur selle degenereerida, mistõttu see ei vasta kõrge temperatuuriga polümeraasi degeneratsiooni ahelreaktsioonile.Tänapäeval kasutatavad ensüümid (nimetatakse Taq polümeraasiks) eraldati 1976. aastal kuumaveeallika bakterist Thermus aquaticus. Selle eripäraks on see, et see talub kõrget temperatuuri ja on ideaalne ensüüm, kuid seda kasutatakse laialdaselt pärast 1980. aastaid.PCR-i algse primitiivse prototüübi esialgne kontseptsioon sarnaneb geenide parandamise ja kopeerimisega, mille pakkus välja dr KJell Kleppe 1971. aastal. Ta avaldas esimese lihtsa ja lühiajalise geenikoopia (sarnane PCR kahe esimese tsükli reaktsiooniga).Täna väljatöötatud PCR töötas välja dr. Kary B. Mullis 1983. aastal. Dr Mullis teenis sel aastal PE-ettevõtteid, seega on PE-l PCR-tööstuses eristaatus.Dr Mullis avaldas ametlikult esimese seotud artikli koos Saiki ja teistega 1985. aastal. Sellest ajast peale on PCR-i kasutatud tuhandeid miile päevas ja võib öelda, et seotud paberite kvaliteet muudab paljud teised uurimismeetodid ebameeldivaks.Seejärel kasutatakse PCR-tehnoloogiat laialdaselt bioloogilistes teadusuuringutes ja kliinilistes rakendustes, muutudes molekulaarbioloogia uuringute kõige olulisemaks tehnoloogiaks.Mullis võitis ka 1993. aasta Nobeli keemiaauhinna.

PCRPõhimõte

PCR-tehnoloogia põhiprintsiip on sarnane DNA loomuliku replikatsiooniprotsessiga ja selle spetsiifilisus sõltub oligonukleotiidpraimerist, mis on komplementaarne sihtjärjestuse mõlema otsaga.PCR koosneb degeneratsiooni-anniilimise-pikenemise kolmest põhireaktsiooni etapist: ①Matriits-DNA degeneratsioon: Pärast matriitsi DNA kuumutamist umbes 93 °C-ni teatud aja jooksul, kaheahelalise DNA kahekordne DNA lahus, mis moodustub matriitsi DNA lahkumise PCR-i amplifikatsioonil, muudab selle üheks ahelaks järgmise vooru praimeri reaktsiooniks.②Matriits-DNA ja praimeri anniilimine (ühend): pärast matriitsi DNA kuumutamist ja degenereerimist üheks ahelaks langeb temperatuur umbes 55 °C-ni.Praimeri ja matriitsi DNA üheahelaline komplementaarne järjestus.③ Praimeri pikendamine: DNA matriits – praimeri sidumine põhineb TaqDNA polümeraasi toimel, kusjuures reaktsiooni tooraineks on dNTP.Jälgige replikatsiooni põhimõtet, sünteesige uus poolreserveeritud koopiaahel, mis täiendab matriitsi DNA ahelat, ja korrake tsükli degeneratsiooni-anniilimist-pikenemist kolm protsessi võib saada rohkem "poolreserveeritud koopiaahelat" ja see uus ahel on jälle saadaval. Hakka järgmise tsükli malliks.Silmuse läbimiseks kulub 2-4min, sihtgeeni saab amplifitseerida mitu miljonit korda 2-3 tunniga.

StandardPCRReaktsioonisüsteem

PCR reaktsiooni viis elementi

PCR reaktsioonis osaleb peamiselt viit tüüpi aineid, nimelt praimer, ensüüm, dNTP, matriits ja puhver (vajalik on Mg2+).[PCR protseduur]

Standardne PCR-protsess on jagatud kolmeks etapiks

1. DNA degeneratsioon (90°C-96°C): kaheahelalised DNA matriitsid termilise toime all, vesiniksidemed katkevad, moodustades üheahelalise DNA.

2. Lõõmutamine (25 ℃ -65 ℃): süsteemi temperatuuri alandatakse, praimer kombineeritakse DNA matriitsiga, moodustades kohaliku kaheahelalise ahela.

3. Laiendamine (70℃ -75℃): Taq ensüümi toimel (umbes 72°C, parim aktiivsus) kasutatakse toorainena dNTP-d, mis ulatuvad praimeri 5′ otsast → 3′ otsast, süntees ja matriits täiendavad teineteist DNA ahelad.

Iga tsükkel denatureeritakse, lõõmutatakse ja pikendatakse, kahekordistades DNA sisaldust.Praegu saab lühikese amplifikatsiooniala tõttu osa PCR-i replitseerida väga lühikese ajaga isegi siis, kui Taq ensüümi aktiivsus ei ole optimaalne, seega saab seda muuta kaheastmeliseks ehk anniilimise ja pikendamise saab läbi viia 60°C-65°C samaaegselt.Tõstmise ja jahutamise protsessi vähendamiseks ja reageerimiskiiruse parandamiseks.

PCR reaktsiooni omadused

● Kõrge spetsiifilisus

PCR vastuse spetsiifilised otsustavad tegurid on: ① Praimeri ja matriitsi DNA spetsiifiline kombinatsioon.② Aluse sidumise põhimõte.③ TaqDNA polümeraasi sünteesi reaktsiooni lojaalsus.④Sihtgeeni spetsiifilisus ja konservatiivsus.

Võti on õige praimerite ja mallide kombinatsioon.Praimeri ja matriitsi sidumine ning praimeri ahela pikendamine põhinevad aluselise aluste sobitamise põhimõttel.Polümeraasi sünteesireaktsioonide lojaalsus ja Taq DNA polümeraasi vastupidavus kõrgele temperatuurile matriitsi ja praimeri sidumiseks (ühendi) reaktsioonis saab läbi viia kõrgemal temperatuuril.Kombinatsiooni spetsiifilisus on oluliselt suurenenud.Klamber suudab säilitada kõrge korrektsuse.Valides suure konservatiivsuse ja kõrge konservatiivsusega geneetilise sihtpiirkonna, on selle spetsiifilisus kõrgem.

● Kõrge tundlikkus

PCR-toodete tootmismahtu suurendatakse indeksiga, mis võib laiendada Pickeri algmalli (PG=10-12), et tõsta mikrokontrolleri taset mikrogrammide tasemele (μg= -6).Sihtrakke saab tuvastada 1 miljonist rakust;viiruste tuvastamisel võib PCR-i tundlikkus ulatuda 3 RFU-ni (tühjad laigud moodustasid ühikud);minimaalne avastamismäär bakteriteaduses on 3 bakterit.

● Lihtne ja kiire

PCR peegelduses kasutatakse kõrge temperatuuriga Taq DNA polümeraasi, mis lisab reaktsioonilahuse ühe korraga, see tähendab degeneratsiooni-anniilimise-pikendusreaktsiooni DNA amplifikatsioonilahusele ja veevannile.Üldiselt on amplifikatsioonireaktsioon lõppenud 2 kuni 4 tunniga.Täiustatud tooteid analüüsitakse üldiselt elektrimõõga abil ja need ei pea kasutama isotoope, ei sisalda radioaktiivset saastet ega hõlpsasti reklaami.

● Proovi puhtus on madal

Ei ole vaja viirusi või baktereid eraldada ja rakke kultiveerida.Võimendina saab kasutada DNA toorprodukte ja RNA-d.DNA amplifikatsiooni tuvastamist saab kasutada otse, kasutades selliseid kliinilisi proove nagu veri, kehavedelik, köhapesuvedelik, juuksed, rakud ja eluskuded.

PCRlevinud probleemid

● Valenegatiivne, võimendatud ribasid pole

PCR-reaktsiooni võtmeetappide hulka kuuluvad: ① matriitsi nukleiinhapete valmistamine, ② praimerite kvaliteet ja spetsiifilisus, ③ ensüümide kvaliteet ④ PCR tsükli tingimused.Põhjuse leidmist tuleks ka eeltoodud linkide puhul analüüsida ja uurida.

Mallid: ① matriits sisaldab mitmesuguseid valke, ② matriits sisaldab Taq ensüümi inhibiitorit, ③ mallis olev valk ei ole elimineeritud, eriti kromosoomi rühmavalk.⑤ Demineerija nukleiinhappe degeneratsioon ei ole põhjalik.Kui ensüümide ja praimerite kvaliteet on hea, puudub amplifikatsiooniriba, mis on suure tõenäosusega proovide seedimine.Matriitsi nukleiinhapete ekstraheerimise protsessis on midagi valesti, nii et tõhusa ja stabiilse seedimislahuse valmistamiseks tuleks selle protseduur fikseerida ja mitte suvaliselt muuta.

Ensüümi inaktiveerimine: uut ensüümi või nii vanu kui ka uusi ensüüme tuleks kasutada koos, et analüüsida, kas ensüümi aktiivsus on kadunud või ebapiisav, mis toob kaasa valenegatiivsed tulemused.Tuleb märkida, et mõnikord unustatakse Taq ensüüm või etiidiumbromiid.

Praimer: praimeri kvaliteet, praimeri kontsentratsioon ja kas kahe praimeri kontsentratsioon on sümmeetriline.See on PCR-i ebaõnnestumise tavaline põhjus või suurenev riba ei ole ideaalne ja kaldub hajuma.Mõne partiinumbri praimerite kvaliteediga on probleeme.Kahel praimeril on kõrge ja madal kontsentratsioon, mis põhjustab madala efektiivsusega asümmeetrilist amplifikatsiooni.Vastumeetmed on järgmised: ① Valige ühikute sünteesimiseks hea praimer.② Praimeri kontsentratsioon ei sõltu mitte ainult OD väärtusest, vaid pöörab agar-suhkru geelelektroforeesi tegemiseks tähelepanu ka praimeri algsele vedelikule.Peab olema krundiriba tsoon ja kahe praimeri heledus peaks olema üldiselt ühtlane.Rihm, PCR võib praegu ebaõnnestuda ja see tuleks lahendada praimeri sünteesiüksusega.Kui praimer on kõrge, on heledus madal ja selle kontsentratsioon peab lahjendamisel olema tasakaalus.③ Kruntvärv tuleb maksta ja seda tuleb hoida kõrge kontsentratsiooniga, et vältida külmiku mitmekordset külmumist või pikaajalist külmutamist, mis põhjustab praimeri riknemise ja lagunemise.④ Krundi kujundus on ebamõistlik, näiteks praimeri pikkus on ebapiisav ja praimerite vahele on tekkinud diklaster.

Mg2+kontsentratsioon: Mg2+ioonide kontsentratsioonil on suur mõju PCR amplifikatsiooni efektiivsusele.Liigne kontsentratsioon võib vähendada PCR amplifikatsiooni vastassoost.Kui kontsentratsioon on liiga madal, põhjustab PCR amplifikatsiooni väljund isegi PCR amplifikatsiooni ebaõnnestumise ilma laiendusriba.

Reaktsiooni mahu muutus: PCR amplifikatsioonis kasutatav maht on 20 ul, 30 ul ja 50 ul või 100 uL, PCR amplifikatsiooni rakenduse suur maht määratakse vastavalt teadusliku uurimistöö ja kliinilise testimise erinevatele eesmärkidele.Peale väikeste koguste nagu 20ul tegemist on vaja suuruse tegemisel teha nööriseisund, muidu läheb rikki.

Füüsilised põhjused: transformatsioon on PCR amplifikatsiooni jaoks väga oluline.Kui taandarengu temperatuur on madal, on degeneratsiooniaeg lühike, see esineb tõenäoliselt valenegatiivsetel;liiga madal lõõmutamistemperatuur võib põhjustada mittespetsiifilist võimendust ja vähendada spetsiifilise võimenduse efektiivsust.Mõjutab tugevalt praimerite ja mallide kombinatsiooni, et vähendada PCR amplifikatsiooni efektiivsust.Mõnikord on pikendus- või veeslahustuvas pliidis varieeruvuse, lõõmutamise ja pikendatud temperatuuri tuvastamiseks vaja kasutada standardseid termomeetreid, mis on üks PCR-i ebaõnnestumise põhjusi.

Sihtjärjestuse variandid: sihtjärjestuse esinemisel mutatsiooni või deletsiooni, prototüübi ja matriitsi kombinatsiooni kombineerimisel või sihtjärjestuse puudumise tõttu kaotavad praimer ja matriitsi komplementaarse järjestuse ning selle PCR amplifikatsioon ei õnnestu.

● Valepositiivne

PCR amplifikatsiooniriba näib olevat kooskõlas sihtjärjestuse ribaga ja mõnikord on selle riba puhtam ja kõrgem.

Praimeri kujundus ei ole sobiv: valitud amplifikatsioonijärjestus ja mitteotstarbeline amplifikatsioonijärjestus on homoloogsed, nii et PCR-i amplifikatsioonil on amplifitseeritud PCR-produktid mitteeesmärgipärased järjestused.Sihtjärjestus on liiga lühike või praimer liiga lühike ja see on kalduvus saada valepositiivseks.Tuleb ümber kujundada.

Sihtjärjestuse või amplifikatsiooniproduktide ristreostus: sellel saastel on kaks põhjust: esiteks, kogu genoomi või suurte segmentide ristreostus, mis toob kaasa valepositiivseid tulemusi.Seda tüüpi valepositiivseid tulemusi saab lahendada järgmiste meetoditega: Olge töötamise ajal ettevaatlik ja õrn, et vältida sihtjärjestuse sissehingamist proovipüstolisse või tsentrifugaaltorust välja pritsimist.Kõik reaktiivid või seadmed, välja arvatud ensüümid ja ained, mis ei talu kõrget temperatuuri, tuleb desinfitseerida kõrgsurvega.Tsentrifugaaltorusid ja proove tuleks kasutada korraga.Vajadusel eksponeeritakse reaktsioonitoru ja reagent enne proovide lisamist ultraviolettkiirte kätte, et hävitada olemasolev nukleiinhape.Teiseks väikesed killud õhusaastes.Need väikesed fragmendid on sihtjärjestusest lühemad, kuid neil on teatav homoloogia.Seda saab omavahel ühendada.Pärast praimerite täiendamist saab PCR-produkti laiendada, mis põhjustab valepositiivse produktsiooni.Seda saab kasutada pesa PCR-meetodi vähendamiseks või kõrvaldamiseks.

● Ilmub mittespetsiifiline võimendusriba

Pärast PCR-i amplifikatsiooni ilmunud ribad ei vasta eeldatavale suurusele või on suured või väikesed või samal ajal või samal ajal spetsiifilised amplifikatsiooniribad ja mittespetsiifilised amplifikatsiooniribad.Mittespetsiifiliste ribade tekkimine on järgmine: Esiteks on praimerid mittetäielikult komplementaarsed sihtjärjestusega või praimeri polümerisatsioon diklastri moodustamiseks.Teine on see, et MG2+ioonide kontsentratsioon on liiga kõrge, anniilimistemperatuur liiga madal ja PCR tsüklite arv on seotud.Teiseks ensüümide kvaliteet ja hulk.Sageli on mõne allika ensüümid altid mittespetsiaalsetele ribadele ja teise allika ensüüme ei esine.Mõnikord esineb ka ensüümide mittespetsiifilist amplifikatsiooni.Vastumeetmed on: vajadusel atraktiivsete esemete ümberkujundamine.Vähendage ensüümi kogust või asendage mõne muu allika ensüüm.Vähendage esmase kogust, suurendage sobivalt mallide hulka ja vähendage tsüklite arvu.Suurendage korralikult lõõmutamistemperatuuri või kasutage kahe temperatuuripunkti meetodit (93 °C degeneratsioon, lõõmutamine ja pikendamine umbes 65 °C juures).

● Paista kihiline takud või määrimislint

Mõnikord näib, et PCR-i amplifikatsiooni rakendatakse, kooritud või vaibataoline vöö.Sel põhjusel on ensüümide liigse koguse või ensüümi halva kvaliteedi tõttu dNTP kontsentratsioon liiga kõrge, Mg2+ kontsentratsioon liiga kõrge, anniilimistemperatuur liiga madal ja tsüklite arv liiga palju.Vastumeetmed on järgmised: ①Vähendage ensüümide kogust või muutke mõne muu allika ensüümi.② Vähendage dNTP kontsentratsiooni ③ Vähendage Mg2+ kontsentratsiooni korralikult.④ Suurendage mallide arvu ja vähendage tsüklite arvu.

Seotud tooted

PCR Heroᵀᴹ (koos värviga)

◮ Kõrgem täpsus: 6 korda tavalisest Taq ensüümist;

◮ Kiirem võimenduskiirus

◮ Suurem malli kohandatavus

◮ Kõrgem võimenduse efektiivsus

◮ Keskkonnataluvus on tugevam: asetatakse nädalaks temperatuurile 37°C, säilitades aktiivsuse üle 90%;

◮ Sellel on 5'→3' DNA polümeraasi aktiivsus ja 5'→3' eksonukleaasi aktiivsus, ilma 3'→5' eksonukleaasi aktiivsuseta.

PCR Easyᵀᴹ (värviga)

Ainulaadne reaktsioonisüsteem ja kõrge efektiivsusega Taq DNA polümeraas muudavad PCR-i reaktsioonil suurema amplifikatsioonitõhususe, spetsiifilisuse ja tundlikkuse.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Üheastmeline komplekt muudab pöördtranskriptsiooni ja qPCR kaks reaktsiooni samas katseklaasis, tuleb lisada ainult matriitsi RNA, spetsiifilised PCR praimerid ja RNaasivaba ddH₂O.

◮ Komplekt suudab kiiresti ja tõhusalt kvantitatiivselt analüüsida viiruse RNA-d või jälgida RNA-d.

◮ Komplektis kasutatakse ainulaadset Foregene pöördtranskriptsiooni reaktiivi ja Foregene HotStar Taq DNA polümeraasi kombineerituna ainulaadse reaktsioonisüsteemiga, et tõhusalt parandada amplifikatsiooni efektiivsust ja reaktsiooni spetsiifilisust.

◮ Optimeeritud reaktsioonisüsteem muudab reaktsiooni kõrgema tuvastamistundlikkuse, tugevama termilise stabiilsuse ja parema tolerantsi.

◮ RT-qPCR lihtne^TM(One Step)-SYBR Green I komplektiga on kaasas ROX-i sisemine võrdlusvärv, mida saab kasutada signaali tausta ja signaali vigade kõrvaldamiseks kaevude vahel, mida on klientidel mugav kasutada kvantitatiivsete PCR-seadmete erinevates mudelites.

RT Lihtne^TMII (Master Eelsegu jaoks esimese ahela cDNA sünteesReaalajas PCR)

- Tõhus võimalus eemaldada gDNA, mis võib eemaldada mallist 2 minuti jooksul gDNA.

- Tõhus pöördtranskriptsioonisüsteem, esimese ahela cDNA sünteesi lõpuleviimiseks kulub vaid 15 minutit.

-Keerulised mallid: suure GC-sisaldusega ja keerulise sekundaarse struktuuriga malle saab suure efektiivsusega tagasi pöörata.

-Kõrge tundlikkusega pöördtranskriptsioonisüsteem, pg-taseme mallid võivad saada ka kvaliteetset cDNA-d.

- Pöördtranskriptsioonisüsteemil on kõrge termiline stabiilsus, optimaalne reaktsioonitemperatuur on 42 ℃ ja sellel on endiselt hea pöördtranskriptsiooni jõudlus temperatuuril 50 ℃.