• facebook
  • linkedin
  • Youtube

RT-qPCR on molekulaarbioloogia põhieksperiment ja kõik peavad sellega tuttavad olema.See hõlmab peamiselt kolme etappi: RNA ekstraheerimine, pöördtranskriptsioon cDNA-ks ja reaalajas fluorestseeruv kvantitatiivne PCR.See ei aita, mis toimub?Tõenäoliselt on probleempöördtranskriptsiooni katse!Kuigi tundub, et pöördtranskriptsiooni katses on vaja lisada ainult RNA, dNTP, praimerid japöördtranskriptaastsentrifuugitorusse ja segage hästi, kuid tegelikus tööprotsessis on siiski palju detaile, millele tuleb tähelepanu pöörata.Õpime seda tundma!

Kuidas hinnata RNA kvaliteeti?
cDNA saamiseks on RNA kvaliteet kriitiline!RNA kvaliteeti saab tuvastada peamiselt kahest aspektist:
(1) RNA terviklikkus:RNA terviklikkust saab kontrollida agaroosgeelelektroforeesiga. Võttes näiteks eukarüoote, on täielikul RNA-l kolm selget riba, molekulmassid suurest väikeseni on 28S, 18S ja 5S ning 28S on kaks korda heledam kui 18S;kui on näha kolm riba, kuid riba tüüp on hägune või Difusioon tähendab, et RNA on osaliselt lagunenud.Sel ajal viige viivitamatult läbi pöördtranskriptsiooni reaktsioon ja suurendage sobivalt malli sisestust;kui näha on ainult väikese molekulmassiga riba või riba puudub, on RNA täielikult lagunenud ja seda tuleb uuesti ekstraheerida.Agilent 2100 näitab RNA terviklikkust koos piikide diagrammi ja RIN väärtusega.Kui nukleiinhape on terve, on elektroferogrammi lähtejoon tasane;kui nukleiinhape on tugevalt lagunenud, on baasjoon ebaühtlane ja ilmneb rohkem lagunemispiike;RIN väärtus peegeldab RNA terviklikkust, vahemikus 0-10, mida suurem väärtus, seda parem on RNA kvaliteet.Noh, mida kõrgem on täielikkuse aste.
(2) RNA puhtus:OD260/280 suhet saab tuvastada UV-spektrofotomeetria abil.Kui OD260/280 suhe on vahemikus 1,9–2,1, on puhtus väga hea.
Genoomse DNA jääk võib viia ebatäpsete kvantitatiivsete tulemusteni
Kui RNA ekstraheeritakse, võib saadud RNA seguneda genoomse DNA-ga (gDNA), mida pole puhastatud.Seetõttu segatakse pärast pöördtranskriptsiooni ka cDNA-gagDNA.Allavoolu ajalqPCRreaktsioon,cDNAja gDNA-d võib amplifitseerida samaaegselt, mille tulemuseks on suhteliselt väike CT väärtus, nii et tulemused võivad olla kallutatud.
Mida me siis peaksime selles olukorras tegema?Foregenesoovitab:
(1) Tehke genoomi puhastamine ümberpööratud RNA-le, mida saab RNA ekstraheerimise ajal kolonni ekstraheerimisega eemaldada;
(2) Töödelge ekstraheeritud RNA-d DNaasigaI , kuid lõpetage see EDTA-ga;
pöördtranskriptsiooni reaktiividgenoomi puhastamise moodulitega;

Kuidas valida praimereid pöördtranskriptsiooniks?
Pöördtranskriptsiooni praimerid mõjutavad ka pöördtranskriptsiooni reaktsiooni tulemust.Saate valida pöördtranskriptsiooniks juhuslikud praimerid, Oligo dT või geenispetsiifilised praimerid vastavalt katse konkreetsetele asjaoludele:
(1) Konkreetsed ärakirjad: soovitatakse kasutada geenispetsiifilisi praimereid;
(2) Pikad fragmentide ärakirjad: Soovitatavad on Oligo dT/geenispetsiifilised praimerid;
(3) Pika lõiguga ärakirjade sisefragmendid: geenispetsiifilised praimerid / juhuslikud praimerid / juhuslikud praimerid + Oligo dT.Kui viiakse läbi järgnev qPCR-katse, ei saa Oligo dT-d üksinda kasutada, kuna ainult Oligo dT kasutamine võib põhjustada 3'-otsa kallutatust, mis toob kaasa ebatäpsed qPCR-katse tulemused;
(4) miRNA: Võib kasutada varre- või sabakrundi.

Mitu korda tuleks pöördtranskriptsiooniprodukti cDNA-d kvantifitseerimiseks lahjendada?
Pärast pöördtranskriptsiooniprodukti cDNA saamist on väga oluline, mitu korda tuleks cDNA-d qPCR katsete jaoks lahjendada.Kui cDNA kontsentratsioon on liiga kõrge või liiga madal, võib see mõjutada amplifikatsiooni efektiivsust.Kas cDNA kontsentratsiooni saab mõõta ja kuidas seda teha?
(1) Pöördtranskriptsiooniprodukti cDNA kontsentratsiooni ei saa mõõta, kuna pöördtranskriptsiooniprodukt sisaldab lisaks cDNA produktile ka pöördtranskriptsiooni jääkpuhvrit, pöördtranskriptaasi, praimereid jne, mis häirivad kontsentratsiooni mõõtmistulemusi ja põhjustavad OD260/280, OD260/23 saagise, seega ei peegelda cNAD normi 23.Sel ajal ütlevad mõned sõbrad, et siis mõõdan pärast puhastamist kontsentratsiooni;Siinkohal tahaks Foregene meelde tuletada, et cDNA-d ei soovitata puhastada, kuna ümberpööramisel saadud cDNA pikkus on erinev ja lühike cDNA läheb puhastamisel kaotsi.
(2) Mida siis teha?Enne qPCR katset saab cDNA lahjendusgradienti määrata eelkatse kaudu.Näiteks: kasutage qPCR-katsete mallidena cDNA põhilahust, 10-kordset lahjendust ja 100-kordset lahjendust ning valige lahjendustegur CT väärtusega vahemikus 18–28.

Kuidas tuleks miRNA-sid pöördtranskribeerida?
miRNA on üheahelaline väikese molekuliga RNA, mille suurus on umbes 22 nt ja mis ei kodeeri valku.Selle lühikese pikkuse tõttu on tavapärase qPCR-meetodi abil raske seda otseselt kvantifitseerida, mistõttu on sageli vaja miRNA-d pikendada;tavaliselt kasutatavad miRNA pöördtranskriptsiooni meetodid hõlmavad tüviahela meetodit ja saba meetodit.
Tüviahela meetod on miRNA pikendamine, lisades tüviahela praimereid.Sellel tuvastamismeetodil on suurem tundlikkus ja spetsiifilisus, kuid tuvastamise läbilaskevõime on madal.Üks pöördtranskriptsioon suudab tuvastada ainult ühe miRNA ja sisemise referentsi;saba lisamise meetod koosneb kahest See on lõpule viidud kahe ensüümi ühisel toimel, milleks on PolyA polümeraas ja pöördtranskriptaas.PolyA polümeraas vastutab PolyA sabade lisamise eest miRNA-le, et suurendada selle pikkust, ja pöördtranskriptaas teostab pöördtranskriptsioonireaktsiooni.Sellel meetodil on kõrge tuvastamise läbilaskevõime ja see suudab tuvastada mitu miRNA-d ja sisemisi viiteid ühes pöördtranskriptsioonis, kuid tüviahela meetodi tundlikkus ja spetsiifilisus on madalad.


Postitusaeg: 17. veebruar 2023