PCR on kõige laialdasemalt kasutatav nukleiinhapete amplifikatsioonitehnoloogia ning seda kasutatakse laialdaselt selle tundlikkuse ja spetsiifilisuse tõttu.Kuid PCR nõuab korduvat termilist denatureerimist ja ei saa vabaneda instrumentide ja seadmete kasutamise piirangutest, mis piirab selle kasutamist kliinilistes välikatsetes.

Alates 1990. aastate algusest on paljud laborid hakanud välja töötama püsiva temperatuuri võimendamise tehnoloogiat, mis ei vaja termilist denatureerimist.Nüüd on nad välja töötanud ahela vahendatud isotermilise amplifikatsiooni tehnoloogia, ahela asendamise isotermilise amplifikatsiooni tehnoloogia, rulluva ringi isotermilise amplifikatsiooni tehnoloogia ja sõltuvuse nukleiinhappejärjestusest.Isotermilise võimenduse tehnoloogia ja muud tehnoloogiad. 

Loop-vahendatud isotermiline võimendus

Amplifitseerimise põhimõte põhineb asjaolul, et DNA on dünaamilises tasakaaluolekus umbes 65 °C juures.Kui mis tahes praimer on aluspaar ja laiendatud kaheahelalise DNA komplementaarsele osale, dissotsieerub teine ​​ahel ja muutub üheahelaliseks.

Sellel temperatuuril kasutab DNA 4 spetsiifilist praimerit, et toetuda ahela nihkumise DNA polümeraasile, et panna ahela nihkumise DNA süntees pidevalt ise tsirkuleerima.

Esmalt määrake sihtgeeni 6 spetsiifilist piirkonda F3, F2, F1, B1, B2, B3 ja seejärel kavandage nende 6 spetsiifilise piirkonna põhjal 4 praimerit (nagu on näidatud alloleval joonisel):

Forward sisemine praimer (FIP) koosneb F1c ja F2.

Tagurpidi sisemine praimer (BIP) koosneb B1c-st ja B2-st ning TTTT-d kasutatakse keskel vahetükina.

Välimised praimerid F3 ja B3 koosnevad vastavalt sihtgeeni F3 ja B3 piirkondadest.

LAMP reaktsioonisüsteemis on sisemise praimeri kontsentratsioon mitu korda suurem kui välimise praimeri kontsentratsioon.Sisemine praimer ühendatakse kõigepealt matriitsi ahelaga, et sünteesida komplementaarne ahel, moodustades DNA kaksikahela.Seejärel ühendatakse välimine praimer matriitsi ahelaga, moodustades DNA kaksikahela.BstDNA polümeraasi toimel vabaneb sisemise praimeri poolt sünteesitud komplementaarne ahel.Pärast rida reaktsioone moodustab komplementaarne ahel lõpuks ühe hantlistruktuuriga DNA ahela.

Hantli struktuuriga DNA üksikut ahelat kasutatakse matriitsina, et moodustada pidevalt avatud otsaga siirdeahela struktuuriga DNA.Sisemised ja välimised praimerid suunavad üleminekutüve-silmusstruktuuri DNA-d pidevalt läbima ahela nihkumise ja pikendamise reaktsioone ning lõpuks moodustama mitu erineva pikkusega tüviahela struktuuri.DNA segu.

Silmusvahendatud isotermilise võimenduse eelised ja puudused

LAMP-i eelised:

(1) Kõrge amplifikatsioonitõhusus, mis võib tõhusalt amplifitseerida 1-10 sihtgeeni koopiat 1 tunni jooksul ja amplifikatsiooni efektiivsus on 10-100 korda suurem kui tavalisel PCR-il.

(2) Reaktsiooniaeg on lühike, spetsiifilisus on tugev ja erivarustust pole vaja.

LAMPi puudused:

(1) Nõuded kruntvärvidele on eriti kõrged.

(2) Amplifitseeritud produkti ei saa kasutada kloonimiseks ja sekveneerimiseks, vaid seda saab kasutada ainult hinnangu andmiseks.

(3) Tänu oma tugevale tundlikkusele on sellest lihtne moodustada aerosoole, mis põhjustab valepositiivseid tulemusi ja mõjutab testi tulemusi.

Strandi nihke võimendus

Strand displacement amplification (SDA) on in vitro isotermiline DNA amplifikatsioonitehnika, mis põhineb ensümaatilisel reaktsioonil, mille pakkus esmakordselt välja Ameerika teadlane Walker 1992. aastal.

SDA põhisüsteem sisaldab restriktsiooniendonukleaasi, ahela nihkumisaktiivsusega DNA polümeraasi, kahte paari praimereid, dNTP-sid ning kaltsiumi- ja magneesiumiioone ja puhversüsteeme.

Ahela nihkumise amplifikatsiooni põhimõte põhineb keemiliselt modifitseeritud restriktsiooniendonukleaasi äratundmisjärjestusel siht-DNA mõlemas otsas.Endonukleaas avab lõhe DNA ahelas selle äratundmiskohas ja DNA polümeraas pikendab lõhet 3' otsa ja asendab järgmise DNA ahela.

Asendatud DNA üksikuid ahelaid saab kombineerida praimeritega ja pikendada DNA polümeraasi abil kaheahelalisteks ahelateks.Seda protsessi korratakse pidevalt, nii et sihtjärjestus on tõhusalt võimendatud.

Keerme nihke võimendamise tehnoloogia eelised ja puudused

SDA eelised:

Amplifikatsiooni efektiivsus on kõrge, reaktsiooniaeg on lühike, spetsiifilisus on tugev ja erivarustust pole vaja.

SDA puudused:

Tooted ei ole ühtlased ning osa ühe- ja kaheahelalisi tooteid toodetakse alati SDA tsüklis ning elektroforeesiga tuvastamisel tekib paratamatult saba.

Rolling ring võimendus

Rolling circle amplification (RCA) on välja pakutud, tuginedes patogeensetest organismidest DNA kopeerimise meetodile rullimise teel.See viitab üheahelalise tsirkulaarse DNA kasutamisele matriitsina konstantsel temperatuuril ja spetsiaalse DNA polümeraasi (näiteks Phi29) ) DNA sünteesi toimel, et saavutada sihtgeeni amplifikatsioon.

RCA võib jagada lineaarseks võimenduseks ja eksponentsiaalseks võimenduseks.Lineaarse RCA efektiivsus võib ulatuda 10-ni⁵korda ja eksponentsiaalse RCA efektiivsus võib ulatuda 10-ni⁹korda.

Lihtne eristamine, nagu on näidatud alloleval joonisel, lineaarne amplifikatsioon a kasutab ainult 1 praimerit, eksponentsiaalne amplifikatsioon b on 2 praimerit.

Lineaarset RCA-d nimetatakse ka ühe praimeri RCA-ks.Praimer seondub tsirkulaarse DNA-ga ja seda pikendab DNA polümeraasi toime.Toode on lineaarne üksik ahel, millel on suur hulk korduvaid järjestusi, mis on tuhandeid kordi ühe ahela pikkusest pikemad.

Kuna lineaarse RCA korrutis on alati ühendatud käivituspraimeriga, on signaali lihtne fikseerimine suureks eeliseks.

Eksponentsiaalne RCA, tuntud ka kui Hyper hargnenud amplifikatsiooni HRCA (Hyper hargnenud RCA), eksponentsiaalses RCA-s võimendab üks praimer RCA produkti, teine ​​praimer hübridiseerub RCA produktiga ja laieneb ning asendus on juba seotud RCA tootega. Allavoolu praimerid pikendavad ahelat ning kordavad RCA pikendamist ja asendust, et tekitada dendrifikatsiooniprodukt.

Rulliringi nukleiinhapete amplifikatsiooni eelised ja puudused

RCA eelised:

Kõrge tundlikkus, hea spetsiifilisus ja lihtne töö.

RCA puudused:

Taustaprobleemid signaali tuvastamise ajal.RCA reaktsiooni ajal võivad tsirkuleerimata tabaluku sond ja seondumata sondi matriitsi DNA või RNA genereerida mõningaid taustsignaale. 

Nukleiinhappejärjestusel põhinev amplifikatsioon

Nukleiinhappejärjestusel põhinev amplifikatsioon (NASBA) on uus PCR-i alusel välja töötatud tehnoloogia.See on pidev ja isotermiline nukleiinhappe amplifikatsioon, mida juhib T7 promootorjärjestusega praimerite paar.Tehnoloogia suudab matriitsi RNA-d amplifitseerida umbes 109 korda umbes 2 tunni jooksul, mis on 1000 korda suurem kui tavalisel PCR-meetodil ja ei vaja erivarustust.

Seda tehnoloogiat on kasutatud haiguste kiireks diagnoosimiseks kohe pärast selle ilmnemist ja paljud ettevõtted kasutavad seda meetodit praegu RNA tuvastamise komplektides.

Kuigi RNA amplifikatsioonis saab kasutada ka pöördtranskriptsiooni PCR tehnoloogiat, on NASBA-l omad eelised: seda saab läbi viia suhteliselt konstantse temperatuuri tingimustes ning see on stabiilsem ja täpsem kui traditsiooniline PCR tehnoloogia.

Reaktsioon toimub temperatuuril 41 kraadi Celsiuse järgi ja selle lõpuleviimiseks on vaja AMV (lindude müeloblastoosi viirus) pöördtranskriptaasi, RNaasi H, T7 RNA polümeraasi ja paari praimereid.

Protsess hõlmab peamiselt:

Edasine praimer sisaldab T7 promootori komplementaarset järjestust.Reaktsiooni käigus seondub pärisuunaline praimer RNA ahelaga ja seda katalüüsib AMV ensüüm, moodustades DNA-RNA kaksikahela.

RNaas H seedib RNA hübriidses kaheahelalises ahelas ja säilitab üheahelalise DNA.

Pöördpraimeri ja AMV ensüümi toimel moodustub DNA kaksikahel, mis sisaldab T7 promootorjärjestust.

T7 RNA polümeraasi toimel on transkriptsiooniprotsess lõpule viidud ja toodetakse suur kogus siht-RNA-d.

NASBA eelised:

(1) Selle praimeril on T7 promootorjärjestus, kuid võõral kaheahelalisel DNA-l puudub T7 promootorjärjestus ja seda ei saa amplifitseerida, seega on sellel tehnoloogial kõrge spetsiifilisus ja tundlikkus.

(2) NASBA lülitab pöördtranskriptsiooni protsessi otse amplifikatsioonireaktsiooni, lühendades reaktsiooniaega.

NASBA puudused:

(1) Reaktsioonikomponendid on keerulisemad.

(2) Reaktsiooni maksumuse suurendamiseks on vaja kolme tüüpi ensüüme.