Ct väärtus on fluorestsents-kvantitatiivse PCR-i kõige olulisem tulemuste esitamise vorm.Seda kasutatakse geeniekspressiooni erinevuste või geenikoopiate arvu arvutamiseks.Mis on siis fluorestsentsi kvantifitseerimise Ct väärtus, mida peetakse mõistlikuks?Kuidas tagada Ct väärtuse efektiivne vahemik?
Mis on Ct väärtus?
qPCR võimendusprotsessi ajal vastav amplifikatsioonitsüklite arv (Cycle Threshold), kui amplifitseeritud produkti fluorestsentssignaal jõuab seatud fluorestsentsläveni.C tähistab tsüklit ja T tähistab läve.Lihtsamalt öeldes on Ct väärtus tsüklite arv, mis vastab sellele, millal esialgne matriitsi amplifikatsioon jõuab qPCR-is teatud koguse produktini.Nn “teatud kogus toodet” selgitatakse täpsemalt hiljem.
Mida Ct väärtus teeb?
1. Seos eksponentsiaalse võimenduse, malli hulga ja Ct väärtuse vahel
Ideaalis kogutakse qPCR-i geene eksponentsiaalse amplifikatsiooni teel pärast teatud arvu tsükleid.Seos võimendustsüklite arvu ja produktide hulga vahel on: Amplifitseeritud produkti kogus = algse malli kogus × (1+En) tsüklite arv.Siiski ei ole qPCR reaktsioon alati ideaalses olukorras.Kui amplifitseeritud produkti kogus jõuab "teatud toote koguseni", on tsüklite arv sel ajal Ct väärtus ja see on eksponentsiaalses võimendusperioodis.Seos Ct väärtuse ja algmalli hulga vahel: Malli Ct väärtuse ja malli algkoopia numbri logaritmi vahel on lineaarne seos.Mida suurem on malli algkontsentratsioon, seda väiksem on Ct väärtus;mida madalam on malli algkontsentratsioon, seda suurem on Ct väärtus.
2. Amplifikatsioonikõver, fluorestsentsi lävi ja teatud PCR produkti kogus
QPCR amplifikatsiooniprodukti kogus esitatakse otse fluorestsentssignaali, st amplifikatsioonikõvera kujul.PCR varases staadiumis on amplifikatsioon ideaalsetes tingimustes, tsüklite arv on väike, produktide akumulatsioon on väike ja fluorestsentsi taset ei saa fluorestsentsi taustast selgelt eristada.Pärast seda fluorestsents suureneb ja läheb eksponentsiaalsesse faasi.PCR produkti kogust saab tuvastada teatud hetkel, kui PCR reaktsioon on just eksponentsiaalses faasis, mida saab kasutada "teatud kogusena" ja sellest saab tuletada matriitsi esialgse sisu.Seetõttu on fluorestsentsi läviväärtuseks fluorestsentssignaali intensiivsus, mis vastab teatud kogusele produktile.
PCR-i hilises staadiumis ei näita amplifikatsioonikõver enam eksponentsiaalset amplifikatsiooni ja siseneb lineaarsesse faasi ja platoofaasi.
3.Ct väärtuste reprodutseeritavus
Kui PCR-tsükkel jõuab Ct väärtuse tsükli numbrini, on see just sisenenud tõelise eksponentsiaalse amplifikatsiooni perioodi.Praegu pole väikest viga võimendatud, seega on Ct väärtuse reprodutseeritavus suurepärane, see tähendab, et sama malli võimendatakse erinevatel aegadel või erinevates torudes samal ajal.Amplifitseerimine, saadud Ct väärtus on konstantne.
1.Amplifikatsiooni efektiivsus En
PCR amplifikatsiooni efektiivsus viitab efektiivsusele, millega polümeraas muudab amplifitseeritava geeni amplikoniks.Amplifikatsiooni efektiivsus, kui üks DNA molekul transformeeritakse kaheks DNA molekuliks, on 100%.Amplifikatsiooni efektiivsust väljendatakse tavaliselt kui En.Järgmiste artiklite analüüsi hõlbustamiseks tutvustatakse lühidalt võimenduse efektiivsust mõjutavaid tegureid.
| Mõjutavad tegurid | selgitus | Kuidas hinnata? |
| A. PCR inhibiitorid | 1. Matriits-DNA sisaldab aineid, mis inhibeerivad PCR reaktsiooni, nagu valgud või detergendid.2. Pärast pöördtranskriptsiooni cDNA sisaldab suures kontsentratsioonis matriitsi RNA või RT reagendi komponente, mis võivad samuti pärssida järgnevat PCR reaktsiooni. | 1. Reostuse olemasolu saab hinnata A260/A280 ja A260/A230 vahekorra mõõtmise või RNA elektroforeesi abil.2. Kas cDNA on pärast pöördtranskriptsiooni lahjendatud teatud suhte järgi. |
| B. Krundi vale disain | Praimerid ei lõõmutu tõhusalt | Kontrollige, kas praimerites on praimer-dimeerid või juuksenõelad, mittevastavused ja mõnikord ka sisekujundused. |
| C. Vale PCR reaktsiooniprogrammi ülesehitus | 1. Praimerid ei saa tõhusalt lõõmutada2. DNA polümeraasi ebapiisav vabanemine 3. Pikaajaline kõrge temperatuuriga DNA polümeraasi aktiivsus vähenes | 1. Lõõmutustemperatuur on kõrgem kui praimeri TM väärtus2. Eeldenatureerimise aeg on liiga lühike 3. Reaktsiooniprotseduuri iga etapi aeg on liiga pikk |
| D. Reaktiivide ebapiisav segamine või pipeteerimisvead | Reaktsioonisüsteemis on PCR reaktsiooni komponentide lokaalne kontsentratsioon liiga kõrge või ebaühtlane, mille tulemuseks on PCR amplifikatsiooni mitteeksponentsiaalne võimendus | |
| E. Amplikoni pikkus | Amplikoni pikkus on liiga pikk, üle 300 bp ja võimenduse efektiivsus on madal | Kontrollige, et amplikoni pikkus oleks vahemikus 80-300 bp |
| F. qPCR reaktiivide mõju | DNA polümeraasi kontsentratsioon reagendis on madal või ioonide kontsentratsioon puhvris ei ole optimeeritud, mistõttu Taq ensüümi aktiivsus ei saavuta maksimumi | Võimendusefektiivsuse määramine standardkõvera järgi |
2.Ct väärtuste vahemik
Ct väärtused jäävad vahemikku 15-35.Kui Ct väärtus on väiksem kui 15, loetakse, et amplifikatsioon jääb algtaseme perioodi piiresse ja fluorestsentsi lävi ei ole saavutatud.Ideaalis on Ct väärtuse ja malli algse koopianumbri logaritmi vahel lineaarne seos, st standardkõver.Läbi standardkõvera, kui amplifikatsiooniefektiivsus on 100%, on geeni ühe koopia arvu kvantifitseerimiseks arvutatud Ct väärtus ligikaudu 35. Kui see on suurem kui 35, on malli esialgne koopiaarv teoreetiliselt väiksem kui 1, mida võib pidada mõttetuks.
Erinevate geenide Ct vahemike puhul on geenikoopiate arvu ja amplifikatsiooni efektiivsuse erinevuse tõttu esialgses matriitsi koguses vaja teha geenile standardkõver ja arvutada geeni lineaarne tuvastamisvahemik.
3.Ct väärtuse mõjutegurid
Amplifikatsioonitsüklite arvu ja produkti koguse vahelisest seosest: võimendatud produkti kogus = algse malli kogus × (1 + En) tsükli number, on näha, et ideaaltingimustes mõjutavad algmalli ja En kogus Ct väärtust negatiivselt.Erinevus malli kvaliteedis või võimenduse efektiivsuses põhjustab Ct väärtuse liiga suure või liiga väikese.
4.Ct väärtus on liiga suur või liiga väike
Postitusaeg: 22.02.2023
