• facebook
  • linkedin
  • Youtube

qPCR katsetes on ka praimeri disain väga oluline lüli.See, kas praimerid sobivad või mitte, on tihedalt seotud sellega, kas amplifikatsiooniefektiivsus jõuab standardini, kas amplifitseeritud produktid on spetsiifilised ja kas katsetulemused on kättesaadavad.
Niisiis, kuidas muuta qPCR praimeri spetsiifilisus paremaks?Kõrge võimenduse efektiivsus?
Täna juhatame teid koos qPCR-i praimereid kujundama ja laseme qPCR-praimerite kujundamisel saada eksperimentide tõhusaks pärimusoskuseks.
qPCR praimerite kujundamisel pöörake tavaliselt tähelepanu järgmistele punktidele: praimerid tuleks kavandada võimalikult palju intronite vahel, toote pikkus peaks olema 100-300 bp, Tm väärtus peaks olema võimalikult lähedane 60 ° C-le ning üles- ja allavoolu praimerid peaksid olema võimalikult lähedal ning praimeri lõpp peaks olema G või C jne.
1. Introneid hõlmavate praimerite disain
QPCR-praimerite kavandamisel võib intronite vahel kavandatud praimerite valimine takistada gDNA matriitsi amplifitseerimist ja kõik tooted pärinevad cDNA amplifikatsioonist, kõrvaldades seega gDNA saastumise mõju.
2. Krundi pikkus
Praimeri pikkus on üldiselt vahemikus 18-30 nt ja amplifikatsiooniprodukti pikkust tuleks võimalikult palju reguleerida vahemikus 100-300 bp.
Kui praimer on liiga lühike, viib see mittespetsiifilise võimenduseni ja kui see on liiga pikk, moodustab see kergesti sekundaarse struktuuri (nt juuksenõela struktuur).Kui amplifikatsiooniprodukt on liiga pikk, ei sobi see polümeraasi reaktsiooniks, mis mõjutab PCR amplifikatsiooni efektiivsust.
3. GC sisaldus ja Tm väärtus
Praimerite GC sisaldus peaks olema vahemikus 40% kuni 60%.Kui see on liiga kõrge või liiga madal, ei soodusta see reaktsiooni käivitamist.Sama Tm väärtuse ja anniilimistemperatuuri saamiseks peaks päri- ja tagurpidi praimerite GC sisaldus olema peaaegu sama.
Tm väärtus peaks olema nii palju kui võimalik vahemikus 55–65 °C, üldiselt umbes 60 °C, ning üles- ja allavoolu Tm väärtus peaks olema võimalikult lähedane, eelistatavalt mitte üle 4 °C.
4. Vältige A valimist praimeri 3′ otsas
Kui praimeri 3′ ots ei sobi, on erinevate aluste sünteesi efektiivsuses suured erinevused.Kui viimane alus on A, võib see algatada ka ahelsünteesi isegi mittesobivuse korral ja kui viimane alus on T When , väheneb ebakõla esilekutsumise efektiivsus oluliselt.Seetõttu proovige vältida krundi 3′ otsas A valimist ja parem on valida T.
Kui tegemist on sondi praimeriga, ei saa sondi 5′ ots olla G, sest isegi kui üks G-alus on ühendatud FAM-i fluorestseeruva reporterrühmaga, võib G kustutada ka FAM-rühma poolt väljastatud fluorestsentssignaali, mille tulemuseks on valenegatiivsed tulemused.Ilmuma.
5. Baasjaotus
Nelja aluse jaotus praimeris on eelistatavalt juhuslik, vältides rohkem kui 3 järjestikust G või C 3'-otsas ja rohkem kui 3 järjestikustG-d või C-d on lihtne luua GC-rikkas järjestuse piirkonnas.
6. Praimeri disainipiirkond peaks vältima keerulisi sekundaarstruktuure.
Amplifikatsiooniprodukti ühest ahelast moodustatud sekundaarne struktuur mõjutab PCR sujuvat kulgu.Ennustades eelnevalt, kas sihtjärjestuses on sekundaarne struktuur, proovige praimerite kujundamisel seda piirkonda vältida.
7. Praimerid ise ja praimerite vahel peaksid püüdma vältida järjestikuseid komplementaarseid aluseid.
Praimeri enda ja praimeri vahel ei saa olla järjestikust 4-aluselist komplementaarsust.Praimeril endal ei tohiks olla komplementaarset järjestust, vastasel juhul voldib see juuksenõela struktuuri, mis mõjutab praimeri ja malli anniilimiskombinatsiooni.
Ülesvoolu ja allavoolu praimerite vahel ei saa eksisteerida komplementaarseid järjestusi.Praimerite komplementaarsus tekitab praimerite dimeere, mis vähendab PCR efektiivsust ja mõjutab isegi kvantitatiivset täpsust.Kui krunt-dimeeri ja juuksenõela struktuurid on vältimatud, ei tohiks △G väärtus olla liiga kõrge (peaks olema alla 4,5 kcal/mol).
8. Praimerid võimendavad sihtspetsiifilist produkti.
QPCR tuvastamise lõppeesmärk on mõista sihtgeeni arvukust.Kui toimub mittespetsiifiline amplifikatsioon, on kvantifitseerimine ebatäpne.Seetõttu tuleb pärast praimerite väljatöötamist neid testida BLAST-iga ja toodete spetsiifilisust võrreldakse järjestuste andmebaasis.
Järgmisena võtame qPCR praimerite kujundamiseks näitena inimese GAS6 (kasvu peatamise spetsiifilise 6) geeni.
01 päringu geen
Homo GAS6NCBI kaudu.Siin peaksime tähelepanu pöörama geeninime ja liikide võrdlemisele, et tagada nende järjepidevus.
o102 Leidke geenijärjestus
(1) Kui sihtjärjestus on genoomne DNA, valige esimene, mis on geeni genoomne DNA järjestus.
o2(2) Kui sihtjärjestus on mRNA, valige teine.Pärast sisestamist klõpsake allolevas tabelis "CDS".Pruun taustajärjestus on geeni kodeeriv järjestus.
o303 Disainkrundid
Sisestage liides Primer-BLAST
o4Sisestage vasakus ülanurgas geeni järjenumber või Fasta formaadis järjestus ja sisestage vastavad parameetrid.
o5o6
Klõpsake nuppu „Hangi praimerid” ja NCBI ilmub, et teavitada teid, et sellist parameetrite valikut võimendatakse muude splaissimise variantidega.Saame kontrollida erinevaid splaissimise variante ja esitada need sobiva praimeripaari saamiseks (nagu on näidatud alloleval joonisel).Selle protsessi käivitamiseks võib kuluda kümneid sekundeid.
o7o8Nende praimeripaaride lõõmutamistemperatuurid on kõik umbes 60 °C.Vastavalt katse eesmärgile vali katseks mõõduka pikkusega, hea spetsiifilisusega ja väiksema isetäiendusega praimerid, mille õnnestumisprotsent on üsna kõrge!
04 Praimeri spetsiifilisuse kontrollimine
Tegelikult saab Primer-Blast lisaks kruntvärvide projekteerimisele hinnata ka meie enda disainitud praimereid.Naaske praimeri disaini lehele, sisestage meie kavandatud üles- ja allavoolu praimerid ning muid parameetreid ei kohandata.Pärast esitamist näete, kas praimerite paar eksisteerib ka teistel geenidel.Kui need kõik kuvatakse geenil, mida tahame võimendada, näitab, et selle praimerite paari spetsiifilisus on suurepärane!(Näiteks see on praimeri päringu ainus tulemus!)
o9

05 Praimeri kvaliteedi hinnang
Milline praimer on "täiuslik" praimer, mis ühendab "võimenduse efektiivsuse standardini", "võimendatud tooteomadused" ja "usaldusväärsed katsetulemused"?
o10Võimendi efektiivsus

011sulamiskõver
Praimerite võimenduse efektiivsus ulatub 90% -110% -ni, mis tähendab, et amplifikatsiooniefektiivsus on hea ja sulamiskõveral on üks tipp ja tavaliselt Tm> 80 ° C, mis tähendab, et amplifikatsiooni spetsiifilisus on hea.
 
Seotud tooted:
Reaalajas PCR lihtne – SYBR GREEN I
Reaalajas PCR Easy-Taqman

 


Postitusaeg: 10.02.2023