Fluorestsents-kvantitatiivne PCR (tuntud ka kui TaqMan PCR, edaspidi FQ-PCR) on uus nukleiinhapete kvantitatiivne tehnoloogia, mille töötas välja PE (Perkin Elmer) USA-s 1995. aastal. See tehnoloogia põhineb tavapärasel PCR-il, lisades fluorestsentsmärgisega sonde.Võrreldes paindliku PCR-iga on FQ-PCR-il oma kvantitatiivse funktsiooni realiseerimiseks palju eeliseid.Selle artikli eesmärk on lühidalt kirjeldada tehnoloogia omadusi, põhimõtteid, meetodeid ja rakendusi.
1 Omadused
FQ-PCR-il pole mitte ainult tavalise PCR-i kõrge tundlikkus, vaid ka fluorestseeruvate sondide kasutamise tõttu suudab see fotoelektrilise juhtivuse süsteemi kaudu vahetult tuvastada fluorestsentssignaali muutusi PCR-i võimendamise ajal, et saada kvantitatiivseid tulemusi, mis ületab paljud tavapärase PCR-i puudused, seega on sellel ka DNA hübridisatsiooni kõrge spetsiifilisus ja kõrge spetsiifilisus.
Näiteks tuleb üldisi PCR-produkte jälgida agaroosgeelelektroforeesi ja etiidiumbromiidiga värvimisega ultraviolettvalgusega või polüakrüülamiidgeelelektroforeesi ja hõbedaga värvimisega.See ei nõua mitte ainult mitut tööriista, vaid võtab ka aega ja vaeva.Kasutatavad plekid Etiidiumbromiid on inimkehale kahjulikud ning need keerulised katseprotseduurid pakuvad võimalusi reostuseks ja valepositiivseteks tulemusteks.Kuid FQ-PCR peab proovi laadimise ajal kaane avama vaid üks kord ja järgnev protsess on täielikult suletud toruga töö, mis ei vaja PCR-i järeltöötlust, vältides paljusid puudusi tavapäraste PCR-operatsioonide puhul.Katses kasutatakse üldiselt PE ettevõtte välja töötatud termotsükleri ABI7100 PCR.
Seadmel on järgmised omadused: ① Lai kasutusala: seda saab kasutada DNA ja RNA PCR produktide kvantifitseerimiseks, geeniekspressiooni uurimiseks, patogeenide tuvastamiseks ja PCR tingimuste optimeerimiseks.② Ainulaadne kvantitatiivne põhimõte: fluorestsentsmärgistatud sonde kasutades koguneb fluorestsentsi kogus PCR-tsükliga pärast laserergatust, et saavutada kvantifitseerimise eesmärk.③ Kõrge töötõhusus: sisseehitatud 9600 PCR termotsükler, arvutiga juhitav 1–2 tundi, et lõpetada 96 proovi amplifitseerimine ja kvantifitseerimine automaatselt ja sünkroonselt.④ Geelelektroforeesi pole vaja: proovi pole vaja lahjendada ja elektroforeesida, lihtsalt kasutage spetsiaalset sondi, et tuvastada otse reaktsioonitorus.⑤ Torustik ei saa reostust: kasutusele on võetud ainulaadne täielikult suletud reaktsioonitoru ja fotoelektriline juhtivussüsteem, seega pole vaja reostuse pärast muretseda.⑥Tulemused on reprodutseeritavad: kvantitatiivne dünaamiline ulatus on kuni viis suurusjärku.Seetõttu on selle tehnoloogia edukast väljatöötamisest saadik hinnatud paljude teadusteadlaste poolt ja seda on rakendatud paljudes valdkondades.
2 Põhimõtted ja meetodid
FQ-PCR tööpõhimõte on kasutada Taq ensüümi 5′→3′ eksonukleaasi aktiivsust, et lisada PCR reaktsioonisüsteemi fluorestsentsmärgistatud sond.Sond võib spetsiifiliselt hübridiseeruda praimeri järjestuses sisalduva DNA matriitsiga.Sondi 5' ots on märgistatud fluorestsentsi emissiooni geeniga FAM (6-karboksüfluorestseiin, fluorestsentsi emissiooni piik 518 nm juures) ja 3' ots on märgistatud märgisega The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, thebe ginning 2 fluorkence) on fosforüülitud, et vältida sondi pikendamist PCR amplifikatsiooni ajal.Kui sond jääb puutumatuks, summutab kustutajarühm emiteeriva rühma fluorestsentsi emissiooni.Kui kiirgav rühm on kustutavast rühmast eraldatud, inhibeerimine lõpetatakse ja optiline tihedus lainepikkusel 518 nm suureneb ning selle tuvastab fluorestsentsi tuvastamise süsteem. Renaturatsioonifaasis hübridiseerub sond matriitsi DNA-ga ja pikendusfaasis olev Taq ensüüm liigub koos praimeri pikendusega DNA matriitsi.Kui sond on ära lõigatud, vabaneb summutusefekt ja fluorestsentssignaal vabaneb.Iga kord, kui malli kopeeritakse, katkestatakse sond, millega kaasneb fluorestsentssignaali vabastamine.Kuna vabanenud fluorofooride arvu ja PCR-produktide arvu vahel on üks-ühele seos, saab seda tehnikat kasutada matriitsi täpseks kvantifitseerimiseks.Katseseade kasutab üldiselt PE ettevõtte välja töötatud termotsükleid ABI7100 PCR ja kasutada saab ka muid termotsükleid.Kui katses kasutatakse reaktsioonitüüpi reaktsioonisüsteemi ABI7700, saab pärast reaktsiooni lõppemist kvantitatiivsed tulemused anda otse arvutianalüüsi kaudu.Kui kasutate muid termotsükleriid, peate RQ+, RQ-, △RQ arvutamiseks kasutama fluorestsentsdetektorit, et mõõta samaaegselt fluorestsentssignaali reaktsioonitorus.RQ+ tähistab prooviklaasi fluorestsentskiirguse rühma luminestsentsi intensiivsuse suhet summutusrühma luminestsentsi intensiivsusse, RQ- tähistab nende kahe suhet tühjas katseklaasis, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) tähistab fluorestsentsi andmetöötluse järel saadud tulemuste kogust pärast CR-i kvantitatiivset muutust.Tänu fluorestsentssondide kasutuselevõtule paraneb oluliselt katse spetsiifilisus.Sondi konstruktsioon peaks üldiselt vastama järgmistele tingimustele: ①Sondi pikkus peaks olema umbes 20–40 alust, et tagada sidumise spetsiifilisus.②GC aluste sisaldus on vahemikus 40% kuni 60%, et vältida üksikute nukleotiidjärjestuste dubleerimist.③ Vältige hübridiseerumist või kattumist praimeritega.④ Sondi ja matriitsi vahelise seondumise stabiilsus on suurem kui praimeri ja matriitsi vahelise seondumise stabiilsus, seega peaks sondi Tm väärtus olema vähemalt 5 °C kõrgem kui praimeri Tm väärtus.Lisaks mõjutavad katsetulemusi sondi kontsentratsioon, homoloogia sondi ja matriitsi järjestuse vahel ning sondi ja praimeri vaheline kaugus.
Seotud tooted:
Hiina reaalajas PCR Easyᵀᴹ-Taqman tootja ja tarnija |Foregene (foreivd.com)
Postitusaeg: 15. oktoober 2021
