• facebook
  • linkedin
  • Youtube

Otsene PCR on reaktsioon, mis kasutab amplifikatsiooniks otseselt loomseid või taimseid kudesid ilma nukleiinhappe ekstraheerimiseta.Otsene PCR toimib paljuski nagu tavaline PCR

Peamine erinevus on otseses PCR-is kasutatav kohandatud puhver, proovi saab otse PCR-reaktsiooni allutada ilma nukleiinhappe ekstraheerimiseta, kuid vastavad nõuded on ensüümide taluvuse ja otseses PCR-reaktsioonis osaleva puhvri ühilduvuse osas.

Kuigi tavalistes proovides on rohkem või vähem PCR-i inhibiitoreid, saab otsese PCR-iga ensüümide ja puhvrite toimel siiski saavutada usaldusväärse amplifikatsiooni.Traditsiooniline PCR-reaktsioon nõuab matriitsina kvaliteetset nukleiinhapet, mis võib pärssida PCR-reaktsiooni sujuvat kulgu, kui matriits sisaldab valke ja muid lisandeid.Otsene PCR on praegu üks populaarsemaid tehnoloogiaid molekulaardiagnostika valdkonnas.

01 Otsest PCR-i kasutati algselt loomade ja taimede jaoks

Otsest PCR-i kasutatakse kõige varem loomade ja taimede valdkonnas, näiteks roti, kassi, kana, küüliku, lamba, veise jne veri, kude ja karvad, taimede lehed ja seemned jne, mida kasutatakse genotüpiseerimise, transgeensete, plasmiidide tuvastamise, geenide väljalülitamise analüüsi, DNA allika identifitseerimise, liikide tuvastamise, SNP analüüsi ja muudes valdkondades.

Nendel väljadel on mõned ühised tunnused, see tähendab, et sihtgeeni sisaldus on suhteliselt kõrge ja nukleiinhapete ekstraheerimine on tülikas, nii et otsene PCR ei saa mitte ainult aega säästa ja tulemusi vähesel määral mõjutada, vaid ka kulusid.

Patogeenide tuvastamiseks kasutatav otsene PCR on viimaste aastate küsimus, mõned PCR-reaktiivide tootjad on uuenduste tegemisel selles suunas palju pingutanud.Eriti selles COVID-19 epideemias on turule ilmunud palju selliseid tuvastustooteid, nagu SARS-CoV-2 nukleiinhapete tuvastamise komplekt (multiplex PCR fluorestsentssondi meetod), mille on uurinud ja välja töötanud Foregene ja mis kasutab reaalajas RT PCR tehnoloogiat (rRT-PCR) SARS-2 nucleopharyngeal-CoV kvalitatiivseks tuvastamiseks. tampooniproovid.

Foregene on üks ettevõtteid, mis kasutab Direct PCR tehnoloogiat normaalsete ORF1ab, N, E javariant sugupuu nukleiinhapped inimese ninaneelu või orofarüngeaalsetes tampooniproovides, nagu SARS-CoV-2 B.1.1.7 liini (UK), B.1.351 liini (ZA), B.1.617 liini (IND) ja P.1 liini (BR).

02  Otsese PCR jaoks vajalikud reaktiivid

Proovi lüsaat

Proovilüsaadi saab ise konfigureerida või osta.Erinevate markide lüsaatide koostise erinevus muudab lüüsimisvõime erinevaks ja siis on lüüsimisaeg veidi erinev.Näiteks loomsete koeproovide valmistamiseks on üldiselt soovitatav 30-minutiline või üleöö lüüsimine ning viiruste lüüsilahus jääb vahemikku 3-10 minutit.

PCR põhisegu

Spetsiifilise amplifikatsiooni suurendamiseks ja amplifikatsioonivõime suurendamiseks on soovitatav kasutada kuumkäivitusega DNA polümeraasi.Otsese PCR-i tuumaks on väga tolerantne polümeraas.

Elimineerida või inhibeerida proovis olevad komponendid, mis mõjutavad DNA amplifikatsiooni

Pärast proovi töötlemist lüsaadiga vabanevad valgud, lipiidid ja muud rakujäägid, need ained pärsivad PCR reaktsiooni.Seetõttu nõuab otsene PCR nende tegurite mõju vähendamiseks vastava eemaldamise või inhibiitorite lisamist.

03  Viie otsese PCR teadmispunkti kogum

Esiteks on Direct PCR tehnoloogia otsene PCR tehnoloogia erinevate bioloogiliste proovide jaoks.Selles tehnilises seisukorras ei ole PCR-reaktsiooni läbiviimiseks vaja nukleiinhapet eraldada ja ekstraheerida, koeproovi otse objektina kasutada ja sihtgeeni praimereid lisada.

Teiseks, Direct PCR tehnoloogia ei ole mitte ainult traditsiooniline DNA matriitsi amplifitseerimise tehnoloogia, vaid hõlmab ka RNA matriitsi pöördtranskriptsiooni PCR-i.

Kolmandaks, Direct PCR-tehnoloogia ei teosta mitte ainult otseselt koeproovidega rutiinseid kvalitatiivseid PCR-reaktsioone, vaid hõlmab ka reaalajas qPCR-reaktsioone, mis nõuavad, et reaktsioonisüsteemil oleks tugev taustfluorestsentsi häirevastane võime ja endogeenne fluorestsents kustutab antagonistliku võime.

Neljandaks, Direct PCR tehnoloogiaga sihitud proovid vajavad ainult nukleiinhappemallide vabastamist ja ei eemalda valke, polüsahhariide, soolaioone jne, mis segavad PCR reaktsiooni.Mis eeldab, et nukleiinhappe polümeraasil ja PCR-i segul reaktsioonisüsteemis oleks suurepärane resistentsus ja kohanemisvõime, et tagada ensüümi aktiivsus ja replikatsiooni täpsus keerulistes tingimustes.

Viiendaks on Direct PCR tehnoloogiaga sihitud koeproov ilma nukleiinhappega rikastamiseta ja matriitsi kogus väga väike, mis nõuab reaktsioonisüsteemil äärmiselt kõrget tundlikkust ja amplifikatsiooni efektiivsust.


Postitusaeg: 28. juuni 2021