• facebook
  • linkedin
  • Youtube

Usun, et igaüks puutub PCR-reaktsioonide tegemisel alati kokku selliste või selliste probleemidega, kuid enamiku neist võib liigitada kahte põhiprobleemi:

Liiga väike geenimalli amplifikatsioon (amplifikatsioon);
Liiga palju mittesihtgeeni amplifikatsiooni.
Lisandite kasutamine on üks levinumaid strateegiaid nende probleemide lahendamiseks.Tavaliselt on lisaainetel kaks aspekti:
sekundaarne struktuurgeenidest (sekundaarne struktuur);
Vähendage mittespetsiifilist kruntimist.
Täna tutvustab toimetaja teile lühidalt PCR reaktsioonides levinud lisaaineid ja nende funktsioone.
Lisandid, mis vähendavad sekundaarset struktuuri
sulfoksiid(DMSO)
geeniproovidkõrge GC sisaldusega.Kuid DMSO vähendab oluliselt ka Taq polümeraasi aktiivsust.Seetõttu peavad kõik tasakaalustama malli juurdepääsetavust ja polümeraasi aktiivsust.Toimetaja soovitab katsele sobiva kontsentratsiooni leidmiseks proovida erinevaid DSMO kontsentratsioone, näiteks 2% kuni 10%.
Mitteioonsed pesuained
Mitteioonsed detergendid, nagu 0,1–1% Triton X-100, Tween 20 või NP-40, vähendavad tavaliselt DNA sekundaarset struktuuri.Kuigi see võib suurendada matriitsi geeni amplifikatsiooni, põhjustab see ka probleeme mittespetsiifilise amplifikatsiooniga.Seega sobivad need lisandid hästi madala saagisega PCR-reaktsioonide jaoks ilma prahita, kuid mitte nii hästi suhteliselt ebapuhaste HRV reaktsioonide korral.Teine mitteioonsete detergentide eelis on SDS-i saastumise vähendamine.Tavaliselt viiakse DNA ekstraheerimise käigus SDS PCR-i, mis pärsib oluliselt polümeraasi aktiivsust.Seetõttu võib 0,5% Tween-20 või Tween-40 lisamine reaktsioonile neutraliseerida SDS-i negatiivseid mõjusid.
Betaiin_
Betaiin võib parandada DNA amplifikatsiooni, vähendades sekundaarse struktuuri moodustumist ja on üldiselt kaubanduslike PCR-komplektide "saladuslik" lisand.Kui soovite kasutada betaiini, peaksite lisama betaiini või betaiini monohüdraati (Betain või Betaiin monohüdraati), kuid mitte betaiinvesinikkloriidi (Betain HCl), reguleerige lõppkontsentratsioonini 1-1,7 M.Betaiin võib samuti aidata parandada spetsiifilisust, kuna see välistab DNA sulamise/DNA denaturatsiooni sõltuvuse aluspaaride koostisest.
Lisandid mittespetsiifilise kruntimise vähendamiseks
Formamiid
Formamiid on tavaliselt kasutatav orgaaniline PCR lisand.See võib kombineerida DNA suuremate ja väiksemate soontega, vähendades seeläbi põhi-DNA kaksikheeliksi stabiilsust ja alandades DNA sulamistemperatuuri.PCR-katsetes kasutatud formamiidi kontsentratsioon on tavaliselt 1–5%.
Tetrametüülammooniumkloriid( TMAC)
Tetrametüülammooniumkloriid võib suurendada hübridisatsiooni spetsiifilisust (hübridisatsiooni spetsiifilisust) ja tõsta DNA sulamistemperatuuri.Seega võib TMAC eemaldada mittespetsiifilise praimimise ja vähendada DNA ja RNA valesti sidumist.Kui kasutatedegenereerunud praimeridPCR-reaktsioonis ärge unustage lisada TMAC-i, mida tavaliselt kasutatakse kontsentratsioonis 15-100 mM.
Muud tavalised lisandid
Lisaks kahele ülalmainitud lisaainete kategooriale on PCR reaktsioonides palju levinud lisaaineid, kuigi neil on erinevad funktsioonid, on need ka väga olulised.
Magneesiumi ioon
Magneesiumioon on polümeraasi asendamatu kofaktor (kofaktor), see tähendab, et ilma magneesiumioonita on polümeraas inaktiivne.Siiski võib polümeraasi efektiivsust mõjutada ka liiga palju magneesiumiioone.Magneesiumiioonide kontsentratsioon igas PCR-reaktsioonis varieerub.Magneesiumioonide kontsentratsiooni mõjutavad kelaativad ained (nagu EDTA või tsitraat), dNTP-de ja valkude kontsentratsioon.Seega, kui teil on PCR-katsega probleeme, võite proovida muuta erinevaid magneesiumiioonide kontsentratsioone, näiteks 1,0–4,0 mM, intervalliga 0,5–1 mM.
Väärib märkimist, et mitu külmutamis-sulatustsüklit võivad viia magneesiumkloriidi lahuse kontsentratsioonikihistumiseni.Seetõttu peate selle enne iga kasutamist täielikult lahustama ja enne kasutamist hoolikalt segama.
Veise seerumi albumiin(veise albumiin, BSA)
Molekulaarkeemia katsetes on veise seerumi albumiin väga levinud lisaaine, eriti restriktsiooniensüümidega seedimise ja PCR katsetes.PCR-reaktsioonides on BSA-st abi saasteainete, näiteks fenoolsete ühendite vähendamisel.Ja väidetavalt võib see vähendada reaktiivide kleepumist katseklaasi seina külge.PCR reaktsioonis võib tavaliselt lisatud BSA kontsentratsioon ulatuda 0,8 mg/ml-ni.
 
Seotud tooted:
PCR kangelane(värviga)
PCR kangelane


Postitusaeg: 10.02.2023