Praimerite ja sondide toimivuse kontrollimine PCR-reaktiivide varases staadiumis ja sobivaimate reaktsioonitingimuste määramine on eelduseks, et tagada formaalsete katsete tõrgeteta edenemine.
Niisiis, kuidas me peame praimeri sondi varajases staadiumis kinnitama?
Peamised näitajad on baasjoon, amplifikatsioonikõver, ct väärtus, võimenduse efektiivsus, madala kontsentratsiooniga proovi tuvastamine, CV jne.
Lähtejoon
Alusjoon on PCR amplifikatsioonikõvera horisontaaljoon.PCR amplifikatsioonireaktsiooni esimestel tsüklitel ei muutu fluorestsentssignaal palju ja moodustab sirgjoone.See sirgjoon on lähtejoon.
PCR praimeri sondide sõelumisel pöörake tähelepanu sellele, kas baasjoon on tasemel.Praimeri sondi kontsentratsiooni puhtus mõjutab baasjoont, näiteks põhjustab baasjoone tõusu või langust.Algtase on ka väga intuitiivne näitaja.
Amplifikatsioonikõver
Teine intuitiivne näitaja on võimenduskõvera kuju.Sekundaarse võimenduse või muude ebanormaalsete võimenduskõverate vältimiseks on kõige parem kasutada S-kujulist kõverat.
Ct väärtus
Tsüklite arv, mis vastab pöördepunktile baasjoonest eksponentsiaalse kasvuni, on Ct väärtus.
Sama proovi puhul annavad erinevad praimeri sondid erinevad amplifikatsioonikõverad ning vastavat Ct väärtust mõjutavad amplifikatsiooni efektiivsus ja interferentsi aste.Teoreetiliselt, mida väiksem on meie valitud praimeri sondi Ct väärtus, seda parem.
Võimendusefektiivsus
Üks usaldusväärsemaid ja stabiilsemaid meetodeid PCR amplifikatsiooni efektiivsuse hindamiseks on standardkõver, mis on ka teadlaste poolt laialdaselt tunnustatud.Meetod hõlmab proovide seeria tegemist, et kontrollida sihtmallide suhtelist arvu.Need proovid tehakse tavaliselt kontsentreeritud põhilahuste seerialahjendustega, kõige sagedamini kasutatakse 10-kordset lahjendust.Kasutades lahjendatud proovide seeriat, kasutades amplifitseerimiseks standardset qPCR programmi, et saada Cq väärtus, ja lõpuks koostada standardkõver vastavalt iga proovi kontsentratsioonile ja vastavale Cq väärtusele, et saada lineaarvõrrand Cq= -klgX0+b ja amplifikatsiooniefektiivsus E=10(-1 /k)-1.Kui kvantitatiivseks analüüsiks kasutatakse qPCR-i, peab amplifikatsiooni efektiivsus jääma vahemikku 90%-110% (3,6>k>3,1).
Madala kontsentratsiooniga proovide tuvastamine
Kui proovi kontsentratsioon on madal, on erinevate praimeri sondide tuvastamise kiirused erinevad.Valime replikatsiooniks 20 madala kontsentratsiooniga proovi ja kõrgeima tuvastamissagedusega praimeri-sondi süsteem on parim.
Variatsioonikoefitsient (CV)
Vastavalt nukleiinhappe amplifikatsiooni tuvastamise reagendi liinistandardile saab erinevate praimersondidega tuvastada 10 korduvat proovi.
Kvantitatiivsed reaktiivid:
Täpsus
Ühe partii täpsus peaks vastama: katsekontsentratsiooni logaritmilise väärtuse variatsioonikoefitsient (CV,%) on ≤5%.Kui proovi kontsentratsioon on madal, on tuvastamiskontsentratsiooni logaritmi variatsioonikoefitsient (CV,%) ≤10%.
Kvalitatiivsed reaktiivid:
Täpsus
Ühe partii täpsus peaks vastama:
(1) Ct väärtuse variatsioonikoefitsient (CV,%) ≤5%
Sama proovi testitakse paralleelselt 10 korda ja testi tulemused peaksid olema järjepidevad
Postitusaeg: 18. september 2021
