Puhangu varases staadiumis on kiire arengu tõttu COVID-19 ennetamise võti kahtlustatavate patsientide kiire diagnoosimine.Mõnel heakskiidetud nukleiinhappe tuvastamise reagendil on lühike väljatöötamisaeg ja esineb probleeme, nagu kiirustatud jõudluse kinnitamine, reaktiivi ebapiisav optimeerimine ja suured erinevused partiide vahel;Erinevate kliiniliste laborite probleemid nukleiinhapete tuvastamise protsessi erinevates aspektides võivad samuti mõjutada nukleiinhapete tuvastamise tulemuste täpsust.See artikkel keskendub praeguse SARS-CoV-2 nukleiinhapete tuvastamise peamistele linkidele ja punktidele ning analüüsib laboratoorse nukleiinhapete tuvastamise vale-negatiivse ja positiivse uuesti läbivaatamise ja kliinilise vastuolu probleeme.

SARS-CoV-2 nukleiinhapete tuvastamise põhimõtted

SARS-CoV-2 on RNA viirus, mille genoomi järjestus on umbes 29 kb ja millel on 10 geeni, mis võivad tõhusalt kodeerida 10 valku.Viirused koosnevad RNA-st ja valkudest ning välimine kiht on lipiididest ja glükoproteiinidest koosnev väliskate.Sees mähib valgukapsiid sellesse RNA-d, kaitstes seeläbi kergesti lagunevat RNA-d (P1).

P1 SARS-COV-2 struktuur

Viirused tungivad rakkudesse läbi spetsiifiliste rakupinna retseptorite, et põhjustada infektsiooni, ja kasutavad paljunemiseks peremeesrakke.

Viiruse nukleiinhapete tuvastamise põhimõte on paljastada viiruse RNA rakulüsaadi kaudu ja seejärel kasutada tuvastamiseks reaalajas fluorestseeruvat pöördtranskriptsiooni-polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR).

Tuvastamispõhimõtte võti on praimerite ja sondide kasutamine, et saavutada nukleiinhappejärjestuste „sihipärane sobivus”, st leida SARS-CoV-2 nukleiinhappejärjestus, mis erineb teistest viirustest umbes 30 000 aluse poolest (nukleiinhappe sarnasus teiste viirustega), „madal“ ala), kavandada praimereid ja sonde.

Praimerid ja sondid on väga sobitatud SARS-CoV-2 nukleiinhappe spetsiifilise piirkonnaga, see tähendab, et spetsiifilisus on väga tugev.Kui testitava proovi reaalajas fluorestseeruva RT-PCR amplifikatsiooni tulemus on positiivne, tõestab see, et proovis on SARS-CoV-2.Vaata P2.

SARS-CoV-2 nukleiinhapete määramise P2 etapid (reaalajas fluorestsents-RT-PCR)

Labori tingimused ja nõuded SARS-CoV-2 nukleiinhapete tuvastamiseks

Nukleiinhapete testimise laborid on kõige ideaalsemad negatiivse rõhuga keskkondade jaoks ning nad peaksid pöörama tähelepanu rõhu jälgimisele, hoidma õhuvoolu ja kõrvaldama aerosoolid.Nukleiinhapete testimisega tegelevatel töötajatel peab olema vastav kvalifikatsioon, nad peavad läbima asjakohase polümeraasi ahelreaktsiooni koolituse ja läbima hindamise.Laborit tuleks rangelt hallata, tsoneerida ja asjassepuutumatutel töötajatel on rangelt keelatud siseneda.Puhas ala tuleb ventileerida ja kohapeal desinfitseerida.Asjakohased esemed paigutatakse tsoonidesse, puhtad ja määrdunud eraldatakse, asendatakse õigel ajal ja puhastatakse saastest.Rutiinne desinfitseerimine: kloori sisaldav desinfitseerimisvahend on peamine lahendus suuremate pindade jaoks ja 75% alkoholi võib kasutada väikestes piirkondades.Hea viis aerosoolidega tegelemiseks on avada ventilatsiooniks aknad, õhu desinfitseerimine võib toimuda ka ultraviolettkiirte, filtreerimise ja õhu desinfitseerimise abil.

SARS-CoV-2 nukleiinhapete määramise võtmelingid ja parameetrid (reaalajas fluorestsents-RT-PCR)

Kuigi laborid pööravad üldiselt suurt tähelepanu nukleiinhapete "tuvastamisele", on tegelikult ka nukleiinhapete "ekstraheerimine" üks eduka tuvastamise võtmeetappe, mis on tihedalt seotud viirusproovide kogumise ja säilitamisega.

Praegu kasutatakse enim kasutatavates hingamisteede proovides, näiteks ninaneelu tampoonides, teist meetodit, mis on nukleiinhappe ekstraheerimise ja lüüsimise lahuse baasil valmistatud inaktiveerimis- (säilitus)lahus.Ühest küljest võib see viiruse säilituslahus denatureerida viiruse valku, kaotada oma aktiivsuse ega olla enam nakkav ning parandada transportimise ja avastamise etapi ohutust;teisest küljest võib see viirust otseselt lõhkuda, et vabastada nukleiinhape, kõrvaldada nukleiinhapet lagundav ensüüm ja ennetada viirust.RNA laguneb.

Viiruse proovivõtulahus, mis on valmistatud nukleiinhappe ekstraheerimise lüüsilahuse põhjal.Peamised komponendid on tasakaalustatud soolad, etüleendiamiintetraäädikhappe kelaativ aine, guanidiini sool (guanidiini isotiotsüanaat, guanidiinvesinikkloriid jne), anioonne pindaktiivne aine (dodekaan) naatriumsulfaat), katioonne pindaktiivne aine (tetradetsüültrimetüülammoonium-Kvinolaat, dihüdroteenoksüoksalaat, dihüdroteenoksiokvinolaat8, p/ muud mitu või enam komponenti.Praegu on nukleiinhapete ekstraheerimise komplekte mitut tüüpi ning kasutatakse erinevaid nukleiinhapete ekstraheerimis- ja puhastusreagente.Isegi kui kasutatakse sama nukleiinhappe ekstraheerimis- ja puhastusreagenti, on iga komplekti ekstraheerimisprotseduurid erinevad.

Praegu valitakse riikliku meditsiinitoodete administratsiooni heakskiidetud nukleiinhapete tuvastamise komplekti tooted SARS-CoV-2 genoomis ORF1ab, E ja N geenide põhjal.Erinevate toodete tuvastamise põhimõtted on põhimõtteliselt samad, kuid nende praimerid ja sondi kujundused on erinevad.Seal on ühe sihtmärgi segmendid (ORF1ab), kahe sihtmärgiga segmendid (ORF1ab, N või E) ja kolme sihtmärgiga segmendid (ORF1ab, N ja E).Erinevused tuvastamise ja tõlgendamise, nukleiinhappe ekstraheerimise ja reaalajas fluorestseeruva RT-PCR reaktsioonisüsteemi vahel peaksid lugema asjakohaseid komplekti juhiseid ning kasutajatel on soovitatav rangelt järgida komplekti tõlgendamise juhistes täpsustatud tõlgendusmeetodit.Reaalajas fluorestseeruva RT-PCR abil amplifitseeritud ühised piirkonnad, praimerid ja sondijärjestused on näidatud P3-s.

P3 SARS-CoV-2 amplikoni sihtmärgi asukoht genoomis ning praimerite ja sondide järjestus

SARS-CoV-2 nukleiinhapete määramise tulemuste tõlgendamine (Rsöö-Time fluorestseeruv RT-PCR)

“SARS-CoV-2 infektsiooni kopsupõletiku ennetamise ja tõrje kava (teine ​​väljaanne)” selgitas esimest korda ühe geeni amplifikatsiooni tulemuste hindamise kriteeriume:

1. Ct puudub või Ct≥40 on negatiivne;

2. Ct<37 on positiivne;

3. Ct väärtus 37-40 on hallskaala ala.Soovitatav on katset korrata.Kui Ct <40 uuesti tegemise tulemusel ja amplifikatsioonikõveral on ilmsed piigid, hinnatakse proov positiivseks, vastasel juhul on see negatiivne.

Juhendi kolmas trükk ja juhendi neljas trükk jätkasid ülaltoodud kriteeriume.Kommertskomplektides kasutatavate erinevate sihtmärkide tõttu ei toodud aga eelmainitud juhendi 3. väljaanne sihtmärkide kombinatsiooni määramise kriteeriume, rõhutades, et ülimuslikud on tootja antud juhised.Alates juhiste viiendast väljaandest on selgitatud kahte eesmärki, eriti ühe raskesti hinnatava sihtmärgi otsustuskriteeriume.See tähendab, et kui labor soovib kinnitada, et juhtum on SARS-CoV-2 nukleiinhappe tuvastamise suhtes positiivne, peab olema täidetud üks kahest tingimusest:

(1) Reaalajas fluorestseeruva RT-PCR-iga testiti positiivselt kaks SARS-CoV-2 sihtmärki (ORF1ab, N) samas proovis.Kui üks sihtmärk on positiivne, on vaja uuesti proovi võtta ja uuesti testida.Kui testi tulemused on Kui üksik sihtmärk on endiselt positiivne, hinnatakse see positiivseks.

(2) Kaks reaalajas fluorestseeruva RT-PCR proovi näitasid samaaegselt ühte positiivset sihtmärki või kaks sama tüüpi proovi andsid ühe positiivse sihtmärgitulemuse, mida võib pidada positiivseks.Kuid juhistes rõhutatakse ka seda, et nukleiinhapete testimise negatiivsed tulemused ei saa välistada SARS-CoV-2 nakatumist.Tuleb välistada tegurid, mis võivad põhjustada valenegatiivseid tulemusi, sealhulgas halb proovi kvaliteet (hingamisteede proovid orofarünksist ja muudest osadest), proovide võtmine liiga vara või liiga hilja, proove ei säilitatud, transporditud ega töödeldud õigesti ning tehnoloogial endal oli probleeme (viiruse variatsioon, PCR inhibeerimine) jne.

SARS-CoV-2 tuvastamise valenegatiivsete tulemuste põhjused

Praegu käsitletav mõiste "valenegatiivne" viitab nukleiinhapete testimisel sageli "valenegatiivsetele", mille puhul nukleiinhappetesti tulemused ei ole kooskõlas kliiniliste ilmingutega, st kliinilised sümptomid ja pildistamise tulemused on COVID-19 suhtes väga kahtlustatavad, kuid nukleiinhappetestid on alati mitu korda "negatiivsed".Riikliku tervisekomisjoni kliinilise labori keskus selgitas "valenegatiivset" SARS-CoV-2 testi.

(1) Nakatunud inimese rakkudes on teatud kogus viirust.Olemasolevad andmed näitavad, et pärast keha nakatumist viirusega satub viirus nina ja suu kaudu kurku, seejärel hingetorusse ja bronhidesse ning seejärel alveoolidesse.Nakatunud inimene kogeb inkubatsiooniperioodi, kergeid sümptomeid ja seejärel raskete sümptomite protsessi ning haiguse erinevaid staadiume.Ja viiruse hulk erinevates kehaosades on erinev.

Rakutüüpide viiruskoormuse osas alveolaarsed epiteelirakud (alumised hingamisteed)> hingamisteede epiteelirakud (ülemised hingamisteed)> fibroblastid, endoteelirakud ja makrofaagid jne;proovi tüübist alveoolide loputusvedelik (kõige Suurepärane)>sügav köhiv röga>nasofarüngeaalne tampoon>suu-neelu tampoon>veri.Lisaks võib viirust tuvastada ka väljaheites.Arvestades operatsiooni mugavust ja patsientide vastuvõttu, on kliiniliseks proovide järjekorraks tavaliselt orofarüngeaalne tampoon>nasaafääre tampoon>bronhide loputusvedelik (keeruline operatsioon) ja sügav röga (tavaliselt kuiv köha, raske saada) .

Seetõttu on viiruse hulk mõne patsiendi orofarünksi või ninaneelu rakkudes väike või äärmiselt madal.Kui testimiseks võetakse ainult orofarünksi või ninaneelu proovid, siis viiruse nukleiinhapet ei tuvastata.

(2) Proovide võtmise ajal ei kogutud viirust sisaldavaid rakke või viiruse nukleiinhapet ei säilitatud tõhusalt.

[① Vale kogumiskoht, näiteks orofarüngeaalsete tampoonide kogumisel ei piisa kogumissügavusest, kogutud ninaneelu tampooniproove ei koguta sügavale ninaõõnde jne. Enamik kogutud rakkudest võivad olla viirusevabad rakud;

② Proovivõtutampoone kasutatakse valesti.Näiteks tampoonipea materjaliks on soovitatav kasutada sünteetilisi kiude nagu PE-kiud, polüesterkiud ja polüpropüleenkiud.Tegelikkuses kasutatakse looduslikke kiude, näiteks puuvilla (tugev valgu adsorptsioon ja seda ei ole lihtne välja pesta) ja nailonkiude (halb veeimavus, mis põhjustab ebapiisava proovivõtu mahu);

③Viiruse säilitamise tuubide ebaõige kasutamine, näiteks polüpropüleenist või polüetüleenist plastist säilitustorude väärkasutamine, mis absorbeerivad kergesti nukleiinhappeid (DNA/RNA), mille tulemuseks on nukleiinhappe kontsentratsiooni vähenemine säilituslahuses.Praktikas on soovitatav kasutada viiruslike nukleiinhapete säilitamiseks polüetüleen-propüleenist polümeerplastist ja mõnda spetsiaalselt töödeldud polüpropüleenist plastikust mahuteid.]

[① Vale kogumiskoht, näiteks orofarüngeaalsete tampoonide kogumisel ei piisa kogumissügavusest, kogutud ninaneelu tampooniproove ei koguta sügavale ninaõõnde jne. Enamik kogutud rakkudest võivad olla viirusevabad rakud;

② Proovivõtutampoone kasutatakse valesti.Näiteks tampoonipea materjaliks on soovitatav kasutada sünteetilisi kiude nagu PE-kiud, polüesterkiud ja polüpropüleenkiud.Tegelikkuses kasutatakse looduslikke kiude, näiteks puuvilla (tugev valgu adsorptsioon ja seda ei ole lihtne välja pesta) ja nailonkiude (halb veeimavus, mis põhjustab ebapiisava proovivõtu mahu);

③Viiruse säilitamise tuubide ebaõige kasutamine, näiteks polüpropüleenist või polüetüleenist plastist säilitustorude väärkasutamine, mis absorbeerivad kergesti nukleiinhappeid (DNA/RNA), mille tulemuseks on nukleiinhappe kontsentratsiooni vähenemine säilituslahuses.Praktikas on soovitatav kasutada viiruslike nukleiinhapete säilitamiseks polüetüleen-propüleenist polümeerplastist ja mõnda spetsiaalselt töödeldud polüpropüleenist plastikust mahuteid.]

(4) Kliinilise labori operatsioon ei ole standarditud.Proovide transpordi- ja säilitustingimused, kliiniliste laborite standardiseeritud töö, tulemuste tõlgendamine ja kvaliteedikontroll on võtmetegurid, mis tagavad testitulemuste täpsuse ja usaldusväärsuse.Tervisekomisjoni kliiniliste laboratooriumide keskuse 16.-24.03.2020 läbiviidud kvaliteedivälise hindamise tulemuste kohaselt oli kehtivad tulemused saanud 844 laborist 701 (83,1%) kvalifitseeritud ja 143 (16,9%) mitte.Kvalifitseeritud, üldised laboritestide tingimused on head, kuid erinevates laborites on siiski erinevusi personali töövõimes, ühe sihtmärgi positiivse proovi tõlgendamise võimes ja kvaliteedikontrollis.

Kuidas vähendada SARS-CoV-2 nukleiinhappe tuvastamise valenegatiivset tulemust?

Valenegatiivsete tulemuste vähendamist nukleiinhapete tuvastamisel tuleks optimeerida valenegatiivsete tulemuste tekitamise nelja aspekti alusel.

(1) Nakatunud inimese rakkudes on teatav kogus viirust.Viiruse kontsentratsioon nakatumiskahtlusega inimeste erinevates kehaosades on erinevatel aegadel erinev.Kui neelu pole, võib see olla bronhide loputusvedelikus või väljaheites.Kui testimiseks saab koguda mitut tüüpi proove korraga või haiguse progresseerumise eri etappides, aitab see vältida valenegatiivseid tulemusi.

(2) Viirust sisaldavad rakud tuleks koguda proovide võtmise ajal.Seda probleemi saab suures osas lahendada proovikogujate koolituse tugevdamisega.

(3) Usaldusväärsed IVD-reaktiivid.Tehes riiklikul tasandil uuringuid reaktiivide tuvastamise tulemuslikkuse hindamise kohta ja arutledes olemasolevate probleemide üle, saab reaktiivide tuvastamise efektiivsust veelgi parandada ja analüüsi tundlikkust parandada.

(4) Kliiniliste laborite standardne töö.Laboripersonali koolituse tugevdamise, labori kvaliteedijuhtimise süsteemi pideva täiustamise, mõistlike jaotuste tagamise ning personali tuvastamisvõime parandamise kaudu on võimalik vähendada valedest laboritoimingutest tulenevaid valenegatiive.

SARS-CoV-2 nukleiinhappetesti uuesti positiivse tulemuse põhjused paranenud ja haiglast lahkunud patsientidel

COVID-19 diagnoosimis- ja raviplaan (seitsmes väljaanne) sätestab selgelt, et COVID-19 patsientide ravimise ja haiglast välja kirjutamise üheks kriteeriumiks on see, et kahel järjestikusel hingamisteede proovil on negatiivne nukleiinhappetest (vähemalt 24-tunnise vahega), kuid väga vähe on erinevaid põhjuseid, miks SARS-CoV-2 nukleiinhappe test oli taas positiivne.

(1)SARS-CoV-2 on uus viirus.On vaja täiendavalt mõista selle patogeenset mehhanismi, tekitatud haiguse täielikku pilti ja haiguse kulgu tunnuseid.Seetõttu on ühelt poolt vaja tugevdada väljakirjutatud patsientide juhtimist ja viia läbi 14-päevane meditsiiniline vaatlus.Viia läbi jälgimist, terviseseiret ja tervisejuhendamist, et süvendada arusaamist kogu haiguse esinemise, arengu ja tulemuse protsessist.

(2) Patsient võib uuesti viirusega nakatuda.Akadeemik Zhong Nanshan ütles: Kuna paranenud patsientidel on antikehad, saavad SARS-CoV-2 antikehad elimineerida, kui nad uuesti sissetungivad.Põhjuseid on palju, mis võivad olla nii paranenud patsiendi põhjuseks kui ka viiruse mutatsiooniga või isegi laboratoorsete uuringute põhjuseks.Kui see on viirus ise, võib SARS-CoV-2 mutatsioon põhjustada paranenud patsiendi toodetud antikehade ebatõhususe muteerunud viiruse vastu.Kui patsient nakatub uuesti muteerunud viirusega, võib nukleiinhappetest olla taas positiivne.

(3) Mis puudutab laboratoorseid katsemeetodeid, siis igal katsemeetodil on oma piirangud.SARS-CoV-2 nukleiinhapete tuvastamine on tingitud geenijärjestuse valikust, reaktiivide koostisest, meetodi tundlikkusest ja muudest põhjustest, mistõttu on olemasolevatel komplektidel oma madalamad tuvastamispiirid.Pärast patsiendi ravi väheneb viirus organismis.Kui viiruskoormus testitavas proovis on alla alampiiri, kuvatakse „negatiivne“ tulemus.See tulemus ei tähenda aga, et viirus organismist oleks täielikult kadunud.Viirus võib olla pärast ravi lõpetamist.Taaselustamine”, jätkake kopeerimist.Seetõttu on soovitatav üle vaadata kord nädalas 2–4 nädala jooksul pärast väljakirjutamist.

(4) Nukleiinhape on viiruse geneetiline materjal.Viirus sureb pärast patsiendi viirusevastast ravi, kuid ülejäänud viiruse RNA fragmendid jäävad inimkehasse ja neid ei väljutata kehast täielikult.Mõnikord võib teatud asjaoludel seda rohkem säilitada.Pikka aega ja sel ajal on nukleiinhappetest "mööduv" positiivne.Patsiendi taastumisaja pikenemisega, pärast seda, kui kehas olevad RNA jääkfragmendid on järk-järgult ammendunud, võib nukleiinhappetesti tulemus muutuda negatiivseks.

(5) SARS-CoV-2 nukleiinhappetesti tulemus tõendab ainult viiruse RNA olemasolu või puudumist ega saa tõestada viiruse aktiivsust ega viiruse edasikandumist.Tuleb tõestada, kas patsient, kellel on taas positiivne nukleiinhappeproov, muutub taas nakkusallikaks.Kliiniliste proovide puhul on vaja läbi viia viiruskultuur ja kultiveerida "elus" viirus, et tõestada, et see on nakkav.

Kokkuvõte

Kokkuvõttes ei saa SARS-CoV-2 nukleiinhappetesti valenegatiivseid tulemusi, kordustesti positiivseid tulemusi ja muid kliiniliste ilmingutega vastuolus olevaid seisundeid täielikult vältida.Tegelikul sõeluuringul ja testimisel on soovitatav kombineerida kliinilisi sümptomeid, pildiuuringuid (CT) ja katseid Laboratoorsete analüüside (nukleiinhappetest + viirusspetsiifiliste antikehade test) tulemused terviklikuks diagnoosimiseks, et vältida diagnoosi tegemata jätmist ja valediagnoosimist.Kui leitakse, et testi tulemused on ilmselgelt vastuolus kliiniliste ilmingutega, on soovitatav läbi viia terviklik analüüs kogu testi lingi (proovide kogumise, ringluse ja töötlemise lingid) kohta, et välistada SARS-CoV-2 viiruse varajane infektsioon, korduv infektsioon või kombineeritud teiste hingamisteede viirusnakkustega jne.Kui tingimused seda võimaldavad, on soovitatav koguda uuesti uurimiseks tundlikumaid proove, nagu röga või alveoolide loputusvedelik.

Seotud tooted:

SARS-CoV-2 nukleiinhappe tuvastamise komplekt (multipleksne PCR fluorestsentssondi meetod)